英文標題：Pyruvate metabolism enzyme DLAT promotes tumorigenesis by suppressing leucine catabolism
中文標題：丙酮酸代謝酶 DLAT 通過抑制亮氨酸分解代謝促進腫瘤發生
發表期刊：Cell Metabolism
影響因子：30.9
研究背景
肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）在全球范圍內的發病率和死亡率呈顯著上升趨勢，代謝重編程在其進展過程中扮演著關鍵角色，主要體現為 Warburg 效應以及支鏈氨基酸（BCAA）代謝的異常改變。丙酮酸作為 Warburg 效應的重要中間產物，其代謝與腫瘤發生密切相關，而丙酮酸脫氫酶（PDH）復合體是連接糖酵解與三羧酸循環（TCA 循環）的關鍵橋梁，其中二氫硫辛酰胺S-乙酰轉移酶（DLAT）作為 PDH 復合體的核心組分，不僅在丙酮酸代謝中通過乙酰基轉移參與乙酰輔酶 A 的生成，還被發現可作為蛋白質乙酰轉移酶修飾其他分子，但它在協調其他代謝通路促進腫瘤生長方面的作用尚未明確。
在支鏈氨基酸代謝中，亮氨酸是激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體 1（mTORC1）通路的關鍵調控因子，它能增強 Rag GTPases 與 Raptor 的結合，從而激活 mTORC1，維持蛋白質合成信號，推動癌細胞快速生長，且肝癌組織中亮氨酸水平升高與 HCC 進展顯著相關。AU RNA 結合甲基戊二酰輔酶 A 水合酶（AUH）是亮氨酸分解代謝中的關鍵酶，負責催化生成 S-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A（HMG-CoA），但其代謝活性的調控機制及其在腫瘤進展中的具體作用仍有待深入探究。
鑒于此，本研究旨在探究 DLAT 是否通過調控亮氨酸代謝參與 HCC 的發生發展，以期揭示 HCC 進展的新機制并為其治療提供新靶點。
技術路線
研究結果
1、肝細胞癌中 DLAT 的高表達與不良預后相關
研究者發現丙酮酸代謝中的 DLAT 與 HCC 有著緊密的關聯：① DLAT 在 HCC 中顯著高表達（圖 1B-D），且其高表達與患者總生存期縮短、疾病特異性生存期和無進展間隔降低密切相關。此外， DLAT 也是 HCC 的獨立風險因素；② DLAT 在惡性細胞中顯著高表達，且其表達水平與惡性細胞比例呈顯著正相關（圖 1E-G）；③ HCC 樣本中 DLAT 表達升高（圖 1I-L）；同樣地，DEN 誘導模型中也發現 DLAT 的高表達（圖 1M-N）；④ DLAT 亦可作為 HCC 的潛在診斷生物標志物。綜上，DLAT 不僅在 HCC 進展中發揮關鍵作用，其表達水平還可作為預后評估和早期診斷的潛在靶點。
圖1. 肝細胞癌中 DLAT 高表達與不良預后相關
2、靶向 DLAT 可抑制體外和體內的腫瘤增殖
基于上述結果，研究者推導并驗證了 DLAT 的表達與癌細胞增殖密切相關：
體外實驗：DLAT 沉默會導致 Huh7 和 HepG2 細胞增殖受到顯著抑制（圖 2A-C）。在構建的 DLAT 敲除穩定細胞系中，HepG2-sgDLAT 細胞的生長速率顯著低于對照組，CCK8 分析結果也與此一致（圖 2C）。
皮下異種移植模型：為驗證 DLAT 對肝癌進展的作用，采用皮下異種移植模型。結果顯示，sgDLAT 組腫瘤生長速率、體積和重量顯著低于對照組（圖 2D-F），且不影響小鼠體重。后續實驗進一步確認 MHCC-97H-sgDLAT 腫瘤中 DLAT 被高效敲除（圖 2G-H）；Ki-67 染色結果也表明，DLAT 缺失會抑制 HCC 增殖（圖 2H-I）。
AAV-DIO-shDLAT 和 MYC/Trp53?/?肝癌模型：為深入研究 DLAT 在肝癌發展中的關鍵作用，研究者構建了 AAV-DIO-shDLAT 和 MYC/Trp53?/?肝癌模型（圖 2J）。結果顯示，AAV-DIO-shDLAT 組在 MYC/Trp53?/?注射 21 天后，腫瘤可見性顯著降低（圖 2K）；30 天后，肝臟腫瘤數量和最大腫瘤體積均顯著減少（圖 2L-N），且肝臟重量無顯著變化，同時證實 DLAT 被高效沉默（圖 2O-Q）。此外，在 HCC 樣本中，AAV-DIO-shDLAT 組的 Ki-67 表達顯著降低（圖 2P, R）。
其他模型驗證：在 DEN/CCl? 模型和 DEN 誘導模型中，也觀察到類似結果，即 DLAT 敲低顯著減少腫瘤進展和 Ki-67 表達。
綜上，DLAT 在體外和體內均是肝癌增殖和進展的關鍵驅動因子。
圖2. 靶向 DLAT 可抑制體外和體內的腫瘤增殖
3、DLAT 缺失對 TCA 循環中間產物影響有限，且通過促進亮氨酸分解代謝調控 HCC 進展
（1）DLAT 缺失對 TCA 循環的影響及補償機制
對 Huh7-sgDLAT 細胞及對照細胞的代謝組學分析顯示，DLAT 缺失僅使細胞內琥珀酸總量下降，對檸檬酸、順烏頭酸等其他 TCA 循環中間產物無顯著影響（圖 3A）。代謝通量分析證實，DLAT 缺失會降低丙酮酸來源的乙酰輔酶 A 及 TCA 中間產物水平，但谷氨酰胺可通過分解代謝補償這一影響 ——DLAT 缺失顯著增加谷氨酰胺來源的α-酮戊二酸、順烏頭酸等 TCA 中間產物，維持循環穩定性。
（2）靶向 DLAT 促進亮氨酸分解代謝及其核心作用
代謝組學深度分析發現，Huh7-sgDLAT 細胞中亮氨酸、天冬氨酸、纈氨酸水平顯著下調（圖 3A-B），質譜分析進一步驗證了這一結果（圖 3E）。功能實驗顯示，僅補充亮氨酸可逆轉 DLAT 缺失導致的細胞生長抑制（圖 3C-D），且亮氨酸水平與 DLAT mRNA 表達呈顯著正相關（圖 3F）。
機制上，DLAT 缺失對 BCAA 相關氨基酸轉運體的表達及功能無顯著影響（圖 3G-H），但代謝通量分析表明其可促進亮氨酸分解代謝 ——sgDLAT 組中源自亮氨酸的 HMG-CoA 和乙酰輔酶 A 水平升高，而上游代謝物 KIC 比例不變，提示 DLAT 不參與亮氨酸轉氨反應（圖 3I-L）。此外，BCAA 分解代謝上調與 HCC 患者更長的總生存期和無病間期相關（圖 3M-N），證實亮氨酸分解代謝在 DLAT 介導的 HCC 進展中起核心作用。
綜上，DLAT 缺失對 TCA 循環的直接影響有限，主要通過調控亮氨酸分解代謝影響 HCC 進展。
圖3. 靶向 DLAT 可促進肝細胞癌中的亮氨酸分解代謝
4、DLAT 缺失通過抑制亮氨酸 - mTOR 信號通路抑制肝細胞癌增殖
為闡明 DLAT 調控 HCC 發展的分子與代謝機制，結合 RNA-seq 與 GSEA 分析，發現 mTOR 信號通路在 DLAT 高表達組顯著富集（圖4A-D），且 DLAT 表達與 mTOR 信號呈正相關。同時，DLAT 缺失也顯著抑制 mTOR、S6K 和 S6 的磷酸化 （圖4E-F），表明 mTOR 信號被阻斷。此外，亮氨酸補充能夠逆轉 DLAT 缺失導致的 mTORC1抑制（圖4G），且恢復 Rag GTP 酶與 Raptor 的相互作用（圖 4H），證實 DLAT 通過亮氨酸調控 mTOR 信號。另一方面，隨著亮氨酸補充， DLAT 缺失對 HCC 細胞增殖的抑制也顯著減弱（圖4I-J）。同樣地，氨基酸信號通路（調控 mTOR 激活）亦與 HCC 患者不良預后相關（圖 4K-L），這些結果都指向著 mTOR 信號異常與 HCC 進展密切相關。綜上， DLAT 缺失通過降低亮氨酸水平抑制 mTOR 信號，從而抑制 HCC 的增殖與進展。
圖4. DLAT 缺失通過抑制亮氨酸 - mTOR 信號通路抑制肝細胞癌增殖
5、DLAT 作為亮氨酸分解代謝酶 AUH 的乙酰轉移酶發揮作用
為闡明背后潛在的分子機制，研究者先是發現了 DLAT 的缺失對關鍵亮氨酸分解代謝酶的蛋白水平影響較小，隨后推測出可能是翻譯后的修飾調控所致，即 DLAT 可能通過調控這些分解代謝酶的乙酰化水平來影響亮氨酸代謝。綜合乙酰化組深度分析（圖 5A-B）和 KEGG 富集（圖 5C）的結果， DLAT 很有可能調控亮氨酸分解代謝酶的乙酰化。
由于亮氨酸代謝酶多定位于線粒體，研究者便在全局線粒體乙酰化水平分析中，發現 DLAT 的缺失顯著降低了部分蛋白的乙酰化水平，隨后鑒定出 47 個與 DLAT 互作的蛋白（圖 5D）。結合乙酰化組學結果以及 BCAA 代謝相關酶數據集，三者交集的 AUH，一種亮氨酸分解代謝酶，被確定為DLAT的潛在乙酰化靶點（圖 5D）。
后經驗證，DLAT 的過表達確實顯著增強了 AUH 乙酰化（圖 5E），而 DLAT 敲除則相反（圖 5F）；體外乙酰化實驗亦證實 DLAT 直接乙酰化 AUH（圖 5G）。聯合酶學特性分析，DLAT 對 AUH 的 Km 值為 0.6753 mM（圖 5H），表明高底物親和力；反應動力學顯示負協同效應（Hill 系數≈0.7462）和濃度依賴性（圖 5I）。
此外，DLAT 與 AUH 在線粒體中共定位（圖 5J）；免疫印跡及 coIP 的結果都確認兩者的直接互作關系（圖 5K-M）；而當 C 端內域（DI）缺失時互作會被破壞，表明 C 端區域對互作至關重要。
綜上，DLAT 直接與 AUH 互作并調控其乙酰化水平。
圖5. DLAT 作為亮氨酸分解代謝酶 AUH 的乙酰轉移酶發揮作用
6、DLAT 介導的 AUH 在 K109 位點的乙酰化促進肝細胞癌進展
在 Huh7-sgDLAT 細胞中，其生長速率顯著低于對照組（圖 6A），而此卻能夠通過 AUH 敲低逆轉其細胞生長抑制（圖 6A）。而在 EdU 染色實驗中，亦觀察到類似結果，即 AUH 敲低緩解了 DLAT 缺失對 HCC 細胞增殖的抑制作用（圖 6B-C）。此外，AUH 敲低也減弱 DLAT 缺失后亮氨酸水平的下降（圖 6D），表明 DLAT 依賴 AUH 調控亮氨酸代謝。
為探索背后調控機制，結合乙酰化組學數據（圖 5A），鑒定出 AUH 的三個潛在乙酰化位點：K109、K160 和 K211（圖 6E）。而其中的 K109 被成功驗證，其應是此調控網絡中關鍵位點（圖 6E-G），同時此位點在物種間高度保守（圖 6H）。
將 K109 位點突變，命名為 AUHK109R，在酶活性驗證中，能夠發現突變體的催化活性顯著高于野生型，證實 K109 乙酰化抑制 AUH 功能（圖 6I）。此外，AUHK109R 過表達還會抑制 mTOR 的激活（圖 6J），EdU 染色也顯示其增殖抑制（圖 6K-L）。
綜上， DLAT 直接乙酰化 AUH 的 K109 位點，抑制其催化活性，從而促進 HCC 增殖。
圖6. DLAT 通過 K109 位點乙酰化抑制 AUH 活性
7、脂質納米顆粒包裝的 AUH 突變體 mRNA 有效抑制體內腫瘤異種移植物的生長
基于上述研究，研究者構建了脂質納米顆粒（LNP）封裝的 AUHK109R 突變體 mRNA 作為新的治療方案。結果顯示，此方案能夠顯著抑制 MHCC-97H 異種移植瘤的生長 ，其腫瘤體積（圖 7A-B）和重量（圖 7C-D）均顯著降低，且各組小鼠體重無顯著差異，同時對腫瘤增殖和干細胞特性也表現出抑制作用（圖 7E-G）。
檢測皮下移植瘤中的亮氨酸水平，發現顆粒治療組中的亮氨酸水平顯著降低（圖 7H），推測 AUH 功能異常可能與亮氨酸代謝紊亂相關。另外，該組中 mTOR 激活被顯著抑制（圖 7I）。
在治療作用方面，與對照組相比，治療組的腫瘤體積和重量顯著降低（圖 7K），Ki-67 和 EpCAM 表達水平（圖 7L-N）和 mTOR 磷酸化水平也都顯著下降（圖 7O），但三組小鼠體重無顯著差異。在安全性評估方面，該方案在 BALB/c 裸鼠中，對正常組織無明顯毒性。
綜上所述，該方案能夠顯著抑制 HCC 腫瘤的生長，且在體內具有良好的安全性，為 HCC 治療提供了新的策略。
圖7. 脂質納米顆粒包裝的 AUH 突變體 mRNA 有效抑制體內腫瘤異種移植物的生長
研究小結
本研究聚焦丙酮酸代謝酶 DLAT 在 HCC 中的作用及機制，發現 DLAT 在 HCC 中高表達且與患者不良預后密切相關。其通過直接乙酰化亮氨酸分解代謝酶 AUH 的 K109 位點，抑制 AUH 活性，導致亮氨酸積累并持續激活 mTORC1 信號通路，從而促進腫瘤增殖。基于此，研究團隊開發的 AUHK109R-mRNA 脂質納米粒（LNP）治療策略，可有效恢復亮氨酸分解代謝、抑制 mTOR 激活，在體內顯著抑制 HCC 生長且安全性良好，為 HCC 治療提供了新靶點和潛在治療方案。