文章標(biāo)題：Integrated network pharmacology and multi-omics reveals GLUD1-mediated α-KG/Glu conversion in regulating amino acid metabolism: a mechanism of Dangua Fang against type 2 diabetes mellitus
發(fā)表期刊：Journal of Ethnopharmacology
影響因子：5.4
客戶單位：福建中醫(yī)藥大學(xué)
百趣提供服務(wù)：AQ700（現(xiàn)已升級為AQ1100高通量靶標(biāo)定量）、中藥成分鑒定
研究背景
2 型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM）作為高發(fā)病率、高致殘率的代謝性疾病，氨基酸代謝紊亂是其關(guān)鍵病理特征之一。三羧酸（TCA）循環(huán)是碳氮代謝核心樞紐，谷氨酸脫氫酶 1（GLUD1）介導(dǎo)的 α- 酮戊二酸/谷氨酸（α-KG/Glu）轉(zhuǎn)化是連接 TCA 循環(huán)與氨基酸代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其功能異常可能是 T2DM 代謝紊亂的重要誘因。擁有兩千余年抗消渴應(yīng)用歷史的中藥復(fù)方丹瓜方（Dangua Fang, DGF），已獲批用于 T2DM 臨床治療，前期研究證實其可改善糖脂代謝與氨基酸代謝，但具
體靶點與機制尚未明確。基于此，本研究聚焦 T2DM 氨基酸代謝紊亂的核心調(diào)控靶點，旨在闡明丹瓜方的干預(yù)機制，為 T2DM 綜合治療提供新的理論依據(jù)與潛在靶點。
研究概述
圖1.實驗設(shè)計與工作流程
研究結(jié)果
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GLUD1 是 T2DM 中調(diào)控氨基酸代謝的關(guān)鍵靶點
成分鑒定與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，丹瓜方含 1929 種化學(xué)成分，核心類別為莽草酸類與苯丙素類、萜類和生物堿類，其中 540 種為血中移行成分（圖 2A-C）。通過多數(shù)據(jù)庫篩選，獲得丹瓜方相關(guān)靶點 838 個、T2DM相關(guān)靶點 21452 個，交集得到 721 個潛在作用靶點（圖 2D-F），PPI網(wǎng)絡(luò)分析確認(rèn)GLUD1）核心靶點（圖 2G）。
KEGG 通路富集分析表明，潛在靶點主要關(guān)聯(lián)丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝等氨基酸代謝通路（圖 2H）。選取丹瓜方 6 種核心血中移行成分與 GLUD1 進(jìn)行分子對接，所有化合物結(jié)合能均低于 -5.0 kcal/mol，證實二者具有強結(jié)合親和力，明確 GLUD1 是丹瓜方調(diào)控 T2DM 的關(guān)鍵靶點（圖 2I）。
圖2.成分鑒定與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析
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丹瓜方可上調(diào)GLUD1蛋白的表達(dá)
蛋白質(zhì)組學(xué)分析在三組樣本中鑒定出 6943 種蛋白質(zhì)，其中 5801 種可定量。主成分分析（PCA）顯示各組樣本聚類清晰、組間分離明顯，提示模型大鼠肝臟蛋白質(zhì)組發(fā)生顯著改變，丹瓜方可部分逆轉(zhuǎn)該變化（圖 3A）。與對照組相比，模型組GLUD1蛋白表達(dá)量顯著降低，而丹瓜方干預(yù)可顯著恢復(fù)其表達(dá)水平（圖 3B）。KEGG 通路富集分析表明，差異表達(dá)蛋白主要富集于色氨酸代謝、酪氨酸代謝、維生素 B6 代謝等氨基酸代謝相關(guān)通路（圖 3C）。GO 富集分析顯示，差異蛋白參與的生物學(xué)過程包括水解酶活性正向調(diào)控、轉(zhuǎn)移酶活性正向調(diào)控等；涉及的細(xì)胞組分以膜的整體組分和固有組分為主；分子功能涵蓋氧化還原酶活性、NAD結(jié)合、酶激活劑活性等（圖 3D）。
綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，證實 GLUD1 是 T2DM 中調(diào)控氨基酸代謝的核心靶點，丹瓜方可通過上調(diào)該蛋白表達(dá)發(fā)揮作用，為后續(xù)機制研究提供了實驗依據(jù)。
圖3.蛋白質(zhì)組學(xué)分析
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丹瓜方可改善 T2DM 大鼠的糖脂代謝異常
本研究共設(shè)置 6 組實驗大鼠，分別為對照組（CON）、模型組（MOD）、丹瓜方組（DAN）、二甲雙胍組（MET）、抑制劑組（INH）、抑制劑聯(lián)合丹瓜方組（IND）。
與對照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）顯著降低，空腹血糖（FBG）、餐后血糖（PBG）、肝重量、肝指數(shù)及糖化血紅蛋白（HbA1c）、總膽固醇（TC）等多項糖脂代謝指標(biāo)顯著升高。
與模型組相比，丹瓜方組與二甲雙胍組在實驗第 7~15 周體質(zhì)量、高密度脂蛋白膽固醇顯著升高，同期空腹血糖、餐后血糖及上述異常升高的代謝指標(biāo)均顯著降低。
與抑制劑組相比，抑制劑聯(lián)合丹瓜方組第 7~15 周體質(zhì)量顯著增加，空腹血糖、餐后血糖及糖化血紅蛋白、總膽固醇等指標(biāo)顯著降低，高密度脂蛋白膽固醇、肝重量及肝指數(shù)有改善趨勢但無統(tǒng)計學(xué)意義（圖 4A~K）。
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丹瓜方可緩解 T2DM 大鼠肝臟病理性損傷
對照組大鼠肝臟 HE、Masson、油紅 O 染色均無明顯異常，模型組、丹瓜方組等其余各組均出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、肝細(xì)胞腫脹、膠原沉積及脂滴蓄積等病理改變，其中模型組與抑制劑組病變最顯著（圖 4N）。
定量分析顯示，模型組膠原纖維和脂質(zhì)沉積面積較對照組顯著增加；丹瓜方組與二甲雙胍組較模型組、抑制劑聯(lián)合丹瓜方組較抑制劑組，上述病理指標(biāo)均顯著降低（圖 4L-N）。
該結(jié)果證實高糖高脂飲食聯(lián)合 STZ 成功構(gòu)建 T2DM 模型，丹瓜方可有效減輕糖尿病大鼠肝臟脂肪變性與纖維化，緩解肝組織損傷，改善肝病理狀態(tài)的效果與二甲雙胍相當(dāng)。
圖4.DGF 對糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用
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丹瓜方可促進(jìn) T2DM 大鼠肝臟三羧酸循環(huán)
與對照組相比，模型組大鼠肝臟中 CS、IDH、SDH 三種關(guān)鍵酶活性顯著降低，CIT、ICIT 等循環(huán)中間產(chǎn)物及 ATP、NAD 等能量相關(guān)物質(zhì)水平均下降，NAD?/NADH 比值也顯著降低。與模型組相比，丹瓜方組和二甲雙胍組上述三種酶活性、多數(shù)中間產(chǎn)物及能量物質(zhì)水平均顯著升高，NAD?/NADH 比值亦顯著升高，僅 SUC、NADH 水平升高無統(tǒng)計學(xué)意義。與抑制劑組相比，抑制劑聯(lián)合丹瓜方組僅 CS 活性、MAL、ATP、NAD?水平及 NAD?/NADH 比值顯著升高，其余酶活性及代謝物水平雖有升高但無統(tǒng)計學(xué)意義（圖 5A–L）。
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丹瓜方可上調(diào) T2DM 大鼠肝臟 GLUD1 表達(dá)并促進(jìn) α-KG/Glu 轉(zhuǎn)化
與對照組相比，模型組大鼠肝臟 α?KG 水平顯著降低、Glu 水平顯著升高，GLUD1 的 mRNA 和蛋白表達(dá)也均顯著下調(diào)。與模型組相比，丹瓜方組和二甲雙胍組能顯著升高 α?KG 水平、降低 Glu 水平，同時顯著上調(diào) GLUD1 的 mRNA 和蛋白表達(dá)。與抑制劑組相比，抑制劑聯(lián)合丹瓜方組的 α?KG 水平顯著升高、Glu 水平顯著降低，GLUD1 的 mRNA 和蛋白表達(dá)也均顯著升高（圖 5M–Q）。
上述結(jié)果證實模型大鼠的三羧酸循環(huán)和 α?KG/Glu 轉(zhuǎn)化過程均受顯著抑制，而丹瓜方可通過上調(diào)肝臟 GLUD1 表達(dá)，促進(jìn) α?KG/Glu 轉(zhuǎn)化、增強三羧酸循環(huán)活性，進(jìn)而改善 2 型糖尿病的代謝異常。
圖5.DGF 對三羧酸循環(huán)及α?酮戊二酸/谷氨酸（α-KG/Glu）轉(zhuǎn)化的影響
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丹瓜方調(diào)控 T2DM 大鼠肝臟氨基酸代謝
本研究代謝組學(xué)分析經(jīng) QC 驗證，數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定、質(zhì)量可靠（圖 6A-B）。PCA 結(jié)果顯示 6 組樣本組內(nèi)聚集、組間分離清晰，模型組與對照組分離顯著，證實造模成功誘導(dǎo)肝臟氨基酸代謝異常；丹瓜方組、二甲雙胍組分布向?qū)φ战M偏移，抑制劑組與抑制劑聯(lián)合丹瓜方組亦明顯分離，提示丹瓜方可改善代謝紊亂、逆轉(zhuǎn) GLUD1 抑制引發(fā)的代謝異常（圖 6C-G）。
采用有監(jiān)督的 OPLS?DA 模型分析，對照組與模型組、模型組與丹瓜方組/二甲雙胍組、抑制劑組與抑制劑聯(lián)合丹瓜方組均清晰分離，各組代謝譜差異顯著；200 次置換檢驗證實模型無過擬合，丹瓜方組 Q² 值偏低或與大鼠個體生物學(xué)差異相關(guān)（圖 6D-G）。從 369 種鑒定代謝物中篩選出 148 種差異代謝物，以氨基酸、多肽及其類似物為主，L-色氨酸、牛磺酸、次牛磺酸為糖脂代謝相關(guān)的核心差異代謝物（圖 6H-I）。火山圖顯示，模型組較對照組 25 種代謝物上調(diào)、86 種下調(diào)；丹瓜方組較模型組 6 種上調(diào)、8 種下調(diào)；二甲雙胍組較模型組 21 種上調(diào)、21 種下調(diào)；抑制劑聯(lián)合丹瓜方組較抑制劑組 12 種上調(diào)、3 種下調(diào)（圖 6J-M）。
聚類熱圖進(jìn)一步明確各組差異代謝物變化：模型組 L-瓜氨酸等上調(diào)、牛磺酸等下調(diào)；丹瓜方組 UDP-D-葡萄糖等上調(diào)、黃素單核苷酸等下調(diào)；二甲雙胍組肌苷酸等上調(diào)、磷酸烯醇式丙酮酸等下調(diào)；抑制劑聯(lián)合丹瓜方組硫胺素等上調(diào)、喹啉-2-羧酸等下調(diào)（圖 7A-D）。
圖6.DGF 對肝臟氨基酸代謝的影響
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T2DM 大鼠肝臟差異代謝物通路分析及靶點篩選
KEGG 富集分析顯示各組差異通路具有特異性：對照組與模型組為總代謝通路、輔因子生物合成、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白；模型組與丹瓜方組為代謝通路、輔因子生物合成、核苷酸代謝；模型組與二甲雙胍組同前述對照組與模型組通路；抑制劑組與抑制劑聯(lián)合丹瓜方組為 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、色氨酸代謝、氨基酸生物合成（圖 7E–H）。
結(jié)合多分析方法及數(shù)據(jù)庫鑒定關(guān)鍵通路，模型組苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成等通路的顯著改變，提示其參與 T2DM 發(fā)病；丹瓜方組核黃素代謝、戊糖與葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、嘌呤代謝通路改變，二甲雙胍組則為甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝等通路變化，抑制劑聯(lián)合丹瓜方組以色氨酸、硫胺素代謝通路改變?yōu)橹鳎鲜鐾窞槎呓堤顷P(guān)鍵靶點（圖 7I–L）。
ROC 分析篩選出系列潛在標(biāo)志物與靶點代謝物：20 個 T2DM 診斷性代謝物、14 個丹瓜方靶點代謝物、20 個二甲雙胍靶點代謝物，及 13 個 GLUD1 調(diào)控的丹瓜方特異性代謝物（圖 7M–P）。
圖7.差異代謝物、代謝通路及ROC分析
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丹瓜方調(diào)控 T2DM 大鼠尿液氨基酸代謝異常
尿液代謝組學(xué)檢測方法經(jīng)驗證，目標(biāo)化合物峰形對稱、分離效果佳，保留時間與峰形一致性良好，可準(zhǔn)確反映尿液代謝物變化（圖 8A-B）。PCA 與 OPLS-DA 分析顯示 6 組樣本組內(nèi)聚集、組間分離清晰，各對比組均實現(xiàn)有效分離且模型無過擬合，證實 T2DM 可顯著改變尿液代謝譜，丹瓜方與二甲雙胍可有效逆轉(zhuǎn)該異常（圖 8C-G）。
本研究共鑒定出 71 種尿液差異代謝物，D - 天冬氨酸、牛磺酸、2 - 氨基異丁酸為與糖脂代謝密切相關(guān)的核心差異代謝物（圖 8H-I）。火山圖顯示，模型組較對照組 1 種代謝物上調(diào)、68 種下調(diào)；丹瓜方組較模型組 65 種上調(diào)、4 種下調(diào)；二甲雙胍組較模型組 33 種上調(diào)、36 種下調(diào)；抑制劑聯(lián)合丹瓜方組較抑制劑組 63 種上調(diào)、6 種下調(diào)（圖 8J-M）。KEGG 富集分析表明，這些差異代謝物主要參與總代謝通路、D -氨基酸代謝及氨基酸生物合成（圖 8N）。
圖8. DGF 對尿氨基酸代謝的影響
研究小結(jié)
本研究整合多組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，結(jié)合 T2DM 大鼠模型及 GLUD1 抑制實驗證實，GLUD1 介導(dǎo)的 α-KG/Glu 轉(zhuǎn)化是 T2DM 氨基酸代謝異常的核心機制。研究發(fā)現(xiàn)，丹瓜方可通過上調(diào)肝臟 GLUD1 表達(dá)，激活 TCA 循環(huán)、促進(jìn) α-KG/Glu 轉(zhuǎn)化，顯著改善模型大鼠糖脂代謝并減輕肝臟損傷；肝、尿代謝組學(xué)進(jìn)一步顯示，丹瓜方能有效逆轉(zhuǎn) T2DM 引發(fā)的氨基酸代謝紊亂，調(diào)控核黃素代謝、嘌呤代謝等脂類相關(guān)通路，其作用機制與二甲雙胍存在明顯差異。該研究明確了 GLUD1 為丹瓜方調(diào)控 T2DM 代謝的核心靶點，闡明了其改善碳氮代謝失衡的分子機制，為 T2DM 綜合治療提供了新策略。