J.Agric.Food Chem.(IF=6.2)|中國熱科院胡偉/丁澤紅團隊突破性成果！解碼木薯塊根3類蛋白修飾圖譜，解鎖淀粉積累與抗逆調控密碼

英文標題：Deciphering the Atlas of Protein Acetylation, 2?Hydroxyisobutyrylation, and Malonylation in Developing Cassava Roots

中文標題：解析木薯塊根發育過程中蛋白質乙?；?-羥基異丁?；捅；揎棃D譜

發表期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry

影響因子：6.2

研究背景

蛋白質翻譯后修飾(Posttranslational modifications, PTMs)是調節蛋白質功能、影響植物生長發育和環境脅迫響應的關鍵機制。其中，賴氨酸乙?；?Kac)、2-羥基異丁酰化(Khib)和丙二?；?Kma)是近年來發現的三種新型賴氨酸?；揎?，它們在多種生物過程中發揮著重要作用。這些PTMs通過改變酶活性、亞細胞定位、蛋白質穩定性和蛋白質-蛋白質相互作用來精細調控蛋白質功能。

木薯(Manihot esculenta)作為全球8億多人口的主食，是一種重要的淀粉塊根作物。其塊根的發育，特別是淀粉的積累，對其產量至關重要。盡管已有大量組學研究關注木薯根系發育、采后生理和逆境脅迫，但針對Kac、Khib和Kma等PTMs在木薯中調控蔗糖/淀粉代謝和淀粉積累的全面研究仍是空白。本研究首次構建木薯發育中塊根中Kac、Khib和Kma修飾的全局蛋白質組學圖譜，旨在揭示這些PTMs在木薯根系發育和生物/非生物脅迫響應中的調控作用。通過深入分析這些修飾的特征、共存模式及其在關鍵代謝途徑中的功能富集，為闡明PTM驅動的植物調控分子機制提供了新的見解。

研究結論

01. 木薯塊根中Kac、Khib和Kma的全局分析

研究以發育中的木薯塊根為實驗材料，通過免疫印跡與質譜分析，明確了Kac、Khib、Kma為木薯中獨立且廣泛存在的蛋白修飾系統（圖1A），并且完成了三類修飾的全局鑒定（圖1B-D）。在修飾位點與蛋白分布上，Khib修飾位點數量最多，且其蛋白中高修飾位點數占比顯著高于Kac和Kma，三類修飾蛋白均以少于5個修飾位點為主（圖1E-G）；修飾頻率方面，三類蛋白均以低頻率修飾為主，Khib蛋白出現高頻率修飾的數量最多（圖1H-J）；對于亞細胞定位，三類修飾蛋白均主要分布在葉綠體、細胞質和細胞核，而同時含三種修飾的蛋白則以細胞質定位為主（圖1K-N）。

圖1. 木薯塊根中Kac、Khib和Kma的全局鑒定與特征分析

02.Kac、Khib和Kma修飾的特征分析

為明確三類修飾的氨基酸偏好特征，研究進一步解析了木薯中Kac、Khib、Kma修飾位點的氨基酸序列特征（圖2A）與基序規律（圖2B）。整體而言，三類修飾位點側翼均富集丙氨酸(A)、賴氨酸(K)、纈氨酸(V)和(Y)、組氨酸(H)存在位點特異性富集：G在Kac/Kma上下游均富集、僅在Khib下游富集，C僅富集于Kac/Kma近端，Y和H為Kac位點特有?；蜩b定發現，Kac的高表達基序數量最多，且16個基序富集倍數超5.0，Khib和Kma則極少；Kac基序多在+1位富集L、I等殘基，超60%的Khib基序側翼含K殘基，Kma無高富集倍數基序。這些結果為木薯蛋白修飾位點的預測提供了關鍵依據。

圖2. Kac、Khib和Kma修飾位點的特征分析及修飾蛋白的重疊性研究

03.Kac、Khib和Kma修飾的重疊分析

基于上述修飾特征，研究還分析了Kac、Khib和Kma修飾的重疊性（圖2C-E），以明確這些修飾是否會共發生在同一賴氨酸位點或同一蛋白上。結果顯示，1239個蛋白、1162個位點同時存在三類修飾，Kac與Khib的共修飾蛋白數（1886個）遠高于Kac-Kma、Khib-Kma組合；單一修飾分析發現，僅Kac、Khib修飾的蛋白數遠多于Kma，表明前兩者的調控范圍更廣。其中，淀粉積累關鍵蛋白APL1為三類修飾共現的典型，其含有5個Kac、14個Khib、4個Kma位點，且K415為三類修飾的共同位點（圖2E）。由此可見，木薯中單個賴氨酸殘基可以經歷多種PTMs，這可能使得蛋白質功能能夠進行協調調控。

04.組蛋白上Kac、Khib和Kma位點的保守性

組蛋白修飾在表觀遺傳調控和基因表達調控中具有關鍵作用。通過解析木薯組蛋白上Kac、Khib、Kma修飾的分布特征（圖3A-B），總計鑒定出23個帶119個修飾位點的組蛋白，其中H2B、H3、H4可被三種修飾共同修飾，H2A僅存在Kac修飾，且無組蛋白同時攜帶Kac和Kma修飾。此外，不同組蛋白的特定位點存在固定的共修飾模式，如H2B的K24、K61為三類修飾共定位點（圖3C）。在序列保守性方面（圖3C），H2A和H4的多個Kac位點、H4的三個Khib位點在木薯、甘蔗、水稻中高度保守；相反，H2B的Kac和Khib修飾保守性極低，木薯與甘蔗間無共享位點；盡管木薯與水稻的H3部分Kac位點也存在保守性，但因缺乏數據，所以暫未發現保守Kma位點。綜合而言，這些保守修飾位點表明Kac和Khib在木薯與其他植物間存在進化保守性，可能參與木薯的重要生物學功能調控。

圖3. Kac、Khib和Kla在組蛋白上的修飾

05.Kac、Khib和Kma蛋白的功能富集分析

借由COG/KOG功能注釋、GO富集及KEGG富集分析，Kac、Khib和Kma修飾蛋白在非組蛋白中的生物學功能被進一步闡明。COG/KOG注釋結果顯示，Kac、Khib和Kma修飾蛋白參與多種生物學過程，主要包括碳水化合物代謝、能量產生與轉化、翻譯后修飾、信號轉導、翻譯以及RNA加工與修飾（圖4A）。GO富集分析表明，這些修飾蛋白參與肽轉運、二羧酸代謝、三羧酸循環代謝過程和丙酮酸代謝（圖4B）。KEGG富集分析發現，Kac、Khib和Kma修飾蛋白顯著富集于三羧酸循環、丙酮酸代謝、糖酵解/糖異生、果糖和甘露糖代謝以及戊糖磷酸途徑（圖4C）。

圖4. Khib蛋白的功能富集分析

06.Kac、Khib和Kma蛋白參與蔗糖和淀粉代謝

蔗糖和淀粉代謝對木薯塊根的生長發育及淀粉積累至關重要。聚焦Kac、Khib、Kma修飾對木薯蔗糖和淀粉代謝的調控作用，研究總計鑒定出29個相關修飾蛋白，覆蓋蔗糖降解、淀粉合成與降解全流程（圖5）。其中，11個核心蛋白（5個蔗糖降解、3個淀粉合成、3個淀粉降解相關）同時發生三類修飾，13個蛋白受Kac和Khib協同修飾，僅3個蛋白為單一修飾。結果而言，Kac與Khib在該代謝通路中協同調控作用顯著，三類修飾共同構成了廣泛且精密的調控網絡，為木薯塊根淀粉積累提供了重要的翻譯后修飾層面調控基礎。

圖5. Kac-、Khib-和Kla-修飾蛋白在能量代謝中發揮作用

07.Kac、Khib和Kma蛋白參與糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑、TCA循環和丙酮酸代謝

聚焦核心碳代謝通路（糖酵解/糖異生、戊糖磷酸途徑、TCA循環及丙酮酸代謝），Kac、Khib、Kma相關的修飾特征也被逐一揭示（圖5）。結果顯示，在四類通路中分別有22、12、26、19個相關蛋白被修飾，且核心特征高度一致：均有大量蛋白（依次為12、5、14、13個）同時發生三類修飾，覆蓋通路全程；多數剩余蛋白以Kac和Khib共同修飾為主，單一修飾或Kac+Kma、Khib+Kma組合的蛋白占比極少。簡言之，Kac、Khib和Kma在木薯能量代謝的調節中起著關鍵作用，并且大多數蛋白質至少受到其中兩種PTM的修飾。

08.Kac、Khib和Kma蛋白參與木質素生物合成

木質素是植物細胞壁的關鍵結構成分，為植物生長發育提供機械強度，Kac、Khib、Kma也廣泛參與著該通路的調控（圖6A-B）。具體而言，總計23個修飾蛋白被鑒定，覆蓋全合成流程，其修飾類型呈現多樣化特征：7個核心蛋白同時發生三類修飾，6個蛋白受Kac和Khib協同修飾，雙修飾組合還包括Kac+Kma、Khib+Kma；單一修飾以Kac為主（6個蛋白），僅1個蛋白為Khib單一修飾，未發現Kma單一修飾的蛋白?？梢?，三類修飾通過多模式組合調控木質素生物合成的關鍵節點，為木薯細胞壁結構形成和機械強度維持提供了重要的翻譯后修飾調控支撐。

圖6. Kac-、Khib-和Kla-修飾蛋白在木質素生物合成、非生物和生物脅迫、激素代謝以及轉錄因子中發揮作用

09.Kac、Khib和Kma蛋白參與脅迫代謝、激素調控及轉錄因子功能

對于生物和非生物脅迫，總計43個修飾蛋白被鑒定（圖6C-D）。其中，3個生物脅迫蛋白(ATLP1a、ATLP1b、RPP8a)和8個非生物脅迫蛋白（STT3A、HSA32等）同時發生三類修飾；17個蛋白為雙修飾類型，含有16個Kac與Khib組合。值得注意的是，96%的非生物脅迫蛋白存在Khib修飾，而所有生物脅迫蛋白均有Kac修飾，表明兩類脅迫通路中PTM修飾偏好存在顯著差異。

對于激素代謝相關蛋白，木薯中共有58個被修飾（圖6E），以脫落酸（ABA，16個）、茉莉酸（14個）、油菜素內酯（8個）和細胞分裂素（8個）相關蛋白居多。ABA合成（ABA2g）、茉莉酸合成（AOS2等）等通路的部分蛋白同時發生三類修飾；茉莉酸和生長素相關蛋白多為Kac與Khib雙修飾，赤霉素相關蛋白多僅含Kac修飾，細胞分裂素相關蛋白多僅含Khib修飾，ABA相關蛋白則半數含Kac、半數含Khib修飾，不同激素通路的PTM偏好性不同。

此外，70個轉錄因子(TF)相關蛋白被修飾（圖6F），以C2H2鋅指（15個）、WRKY（12個）和C3H鋅指（10個）家族為主。僅3個TF蛋白（AGD13等）同時發生三類修飾，且不同家族存在修飾偏好：WRKY家族僅含Kac修飾，ARR家族僅含Khib修飾，Triple-Helix家族多為Kma修飾，C2H2鋅指等家族以Kac修飾為主，近半數同時含Khib修飾。

綜上所述，Kac、Khib和Kma修飾的蛋白質參與調節脅迫代謝、激素和轉錄因子，并在其子類別或子途徑中表現出不同的修飾偏好。

研究總結

本研究首次構建了木薯塊根發育過程中Kac、Khib和Kma的全局蛋白質修飾圖譜，共鑒定出11253個Kac位點、18326個Khib位點和4068個Kma位點，分別分布于5165、4832和1815個蛋白中，明確了三類修飾為木薯中獨立且廣泛存在的調控系統，其修飾蛋白主要定位于葉綠體、細胞質和細胞核，且存在大量共修飾現象。通過特征分析揭示了三類修飾位點的氨基酸偏好與特異性基序，物種比對發現組蛋白上部分Kac和Khib位點具有進化保守性。此外，功能研究表明，修飾蛋白廣泛參與蔗糖/淀粉代謝、糖酵解/糖異生等核心碳代謝通路，以及木質素合成、脅迫響應、激素調控和轉錄因子功能調控，且不同通路中存在顯著的修飾偏好性，證實Kac、Khib和Kma通過協同或特異性修飾，在木薯塊根發育和生物/非生物脅迫適應中發揮關鍵調控作用，為解析植物翻譯后修飾介導的分子機制及木薯遺傳改良提供了重要理論依據與資源支持。

END 

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