結(jié)直腸癌（Colorectal
cancer ，CRC）是最常見的癌癥之一，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)2018年的數(shù)據(jù)顯示全球CRC每年約有180萬的新增病例，90萬的死亡病例。結(jié)直腸癌已經(jīng)成為第三大惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因。
組織病理學(xué)對指導(dǎo)治療方案和預(yù)測預(yù)后有著關(guān)鍵性的作用。 通常大多數(shù)I期患者可以手術(shù)切除治愈，而III期患者則需要采取輔助化療以改善預(yù)后。 部分預(yù)后標(biāo)記物可用來識別具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)且需要后續(xù)治療的II期患者。 但是，化療后的長期效果仍存在很大差異。 所以，需要加入其他生物標(biāo)記物來判定化療有效性。癌癥干細(xì)胞（CSC）存在腫瘤組織中的細(xì)胞亞群里，通過自我更新和無限增殖維持著腫瘤細(xì)胞群的生命力。SOX2（sex-determining region-Y homeobox-2）是在胚胎發(fā)育過程中至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，用于維持多潛能性的干細(xì)胞。已有研究表明SOX2可作為CSC的標(biāo)記物，并且能夠逃脫免疫識別形成轉(zhuǎn)移微環(huán)境造成致癌性增強(qiáng)
西澳大利亞醫(yī)學(xué)院的Platell教授團(tuán)隊(duì)早期對一組III期結(jié)腸癌患者的研究表明，結(jié)果顯示高SOX2 +細(xì)胞密度與不良預(yù)后相關(guān)。但是，其中大多數(shù)患者已經(jīng)接受了輔助化療，因此無法客觀評估SOX2的預(yù)后效果與其作為對化療無反應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)是評估SOX2能否作為真正的結(jié)直腸癌預(yù)后的指標(biāo)還是僅僅化療反應(yīng)的指標(biāo)。
SOX2染色TMA樣本來自797個(gè)II期和III期結(jié)直腸癌患者，其中大部分未接受過化療。利用StrataQuest圖像分析軟件（TissueGnostics）對SOX2 +細(xì)胞密度進(jìn)行定量分析；使用Kaplan–Meier估計(jì)和Cox評估總體生存期。發(fā)現(xiàn)高SOX2 +細(xì)胞密度與較差的總體存活率無關(guān)。而且，所有患者在接受5-氟尿嘧啶（5-FU）治療后生存率均得到顯著改善。因此，SOX2 +的細(xì)胞密度與預(yù)后或化療獲益無關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)論與早期的研究相反，早期研究中，除5-FU外，大多數(shù)患者還接受奧沙利鉑治療。這表明SOX2可以預(yù)測對奧沙利鉑治療的反應(yīng)，但不能預(yù)測5-FU。
該文章發(fā)表在Cancers上。
實(shí)驗(yàn)部分：
TMA組織芯片制備和SOX2染色樣本的定量分析方法是本次實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。
SOX2是異質(zhì)性表達(dá)標(biāo)記物，利用TMA技術(shù)可能會增加假陰性的可能，高表達(dá)的患者數(shù)量增多。這是TMA的普遍局限性。
關(guān)于數(shù)字圖像分析，之前的研究中，使用其他軟件量化分析SOX2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示18％患有高密度SOX2 +細(xì)胞腫瘤。而在本研究中，使用StrataQuest軟件只有10％。StrataQuest軟件通過調(diào)節(jié)散點(diǎn)圖的cut-off線可以消除由于背景染色或組織碎片產(chǎn)生假陽性信號。
使用StrataQuest軟件進(jìn)行SOX2陽性細(xì)胞識別和量化分析的工作流：
首先利用StrataQuest軟件一鍵拆色功能自動識別出SOX2-DAB（棕色）與蘇木素（藍(lán)色）染色通道，并生成灰度圖，便于后續(xù)查看各通道拆**況。而后由于SOX2表達(dá)定位于細(xì)胞核中，我們可以利用DAB通道的灰度圖進(jìn)行核識別，以下是識別并利用紫色圈出的在DAB（棕色）通道（A）和原始彩色圖像（B）上的SOX2細(xì)胞。然后對識別到細(xì)胞進(jìn)行量化分析，包括細(xì)胞核面積、蘇木素及DAB染色強(qiáng)度等參數(shù)，以上數(shù)據(jù)均可自動生成二維散點(diǎn)圖，且散點(diǎn)圖中的每個(gè)點(diǎn)與所需的有效細(xì)胞對應(yīng)。
圖1. SOX2染色組織樣本圖像及定量分析
（A）SOX2低表達(dá)樣本圖像
（B）SOX2高表達(dá)樣本圖像
（C）SOX2高表達(dá)樣本StrataQuest軟件分析圖像。
SOX2染色主要集中在癌細(xì)胞的細(xì)胞核（圖1）。 II期的36例患者（8.1％）和III期疾病的44例患者（12.5％）被認(rèn)為具有較高的SOX2 +細(xì)胞密度（表1）。 未發(fā)現(xiàn)高SOX2表達(dá)與臨床病理變量之間存在顯著相關(guān)性。
圖中為DAB染色強(qiáng)度（X軸）與蘇木素染色強(qiáng)度(Y軸)的散點(diǎn)圖，利用樣本數(shù)據(jù)信息，GATE設(shè)門圈選出SOX2陽性細(xì)胞群（C），并利用正反向回溯功能驗(yàn)證該細(xì)胞群分析結(jié)果，確保準(zhǔn)確性，避免假陰性的出現(xiàn)。散點(diǎn)圖中紅色圈選代表SOX2+細(xì)胞，綠色圈選代表SOX2-細(xì)胞（C）。樣本原圖中識別并紅色圈出的SOX2+細(xì)胞及綠色圈出的SOX2-細(xì)胞（D）。