黑色素瘤組織中，與細胞焦亡相關的基因（PRGs）GZMA、GSDMB、NLRP1、IL18和CHMP4A的陽性細胞比例低于正常皮膚。細胞焦亡是一種影響腫瘤微環境和腫瘤免疫治療的新領域。然而，細胞焦亡的作用仍有爭議，部分原因是由于黑色素瘤的細胞組成異質性。

2023年8月，上海中醫藥研究院皮膚病研究所李斌教授團隊在Cell Death& Disease雜志上發表題為 Clinical-mediated discovery of pyroptosis in CD8+ T cell and NK cell reveals melanoma heterogeneity by single-cell and bulk sequence 的研究論文。

本文對黑色素瘤標本的單細胞轉錄組進行了全面分析。我們發現PRGs的表達在免疫細胞中，如CD8+細胞（代表CD8+ T細胞）和CD57+細胞（代表NK細胞）中失調。此外，免疫組化和多重免疫熒光染色實驗結果進一步證實了GZMA+細胞和GSDMB+細胞主要在免疫細胞中表達，特別是在CD8+ T細胞和NK細胞中。

黑色素瘤標本中，GZMA+合并CD8+ T細胞（0.11%）和GSDMB+合并CD57+細胞（0.08%）的存在量很少，而對照組分別為4.02%和0.62%。這些發現表明，腫瘤中免疫細胞的減少可能降低了細胞焦亡的能力，從而對抗黑色素瘤的特性構成了潛在的風險。

我們根據單細胞和整體RNA-seq分析，構建了一個預后風險模型和個體化的預測模型（C指數=0.58，P = 0.002），提示PRGs在惡性黑色素瘤的預防中可能發揮作用?？傊ㄟ^實驗驗證鑒定了免疫細胞群和免疫基因模塊，有助于我們更好地理解黑色素瘤中的細胞焦亡。

實驗部分

本文中，研究者使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光譜組織掃描定量分析系統獲取圖像。獲取到圖像利用StrataQuest軟件進行定量分析。

Panel 1 ：DAPI，CD8，GZMA，GSDMB

Panel 2：DAPI，CD57，GZMA，GSDMB

雖然細胞焦亡對癌癥的影響尚為有定論，但是也正因為如此，針對細胞焦亡的研究仍然有廣泛的未知等待探索。考慮到細胞焦亡的研究和炎癥反應過程密切相關，借助于TissueFAXS Cytometry技術，結合多色免疫熒光染色，不但可以精準識別焦亡相關特異性蛋白表達的細胞，還可以實現對細胞焦亡水平在組織中的空間分布、形態特征、與其他細胞類型的相互作用等方面的高通量、高精度、高信息量的定量分析。

在單細胞定量水平上，先通過識別細胞核標記對細胞進行計數，繼而借助于Tissue Cytometry的核擴張算法精準對細胞質/膜染色的形態進行識別。在獲得單細胞真實染色的輪廓區域后，對每個細胞蛋白標記的所有像素強度進行統計分析，最終獲得單個細胞蛋白表達的真實強度水平。這種方法用于陽性閾值的精準篩選劃分，甚至更進一步鑒定了陽性細胞與相鄰的陰性細胞的作用關系。

在本文中作者還利用了多組學研究的思路，對黑色素瘤發病機制有關的細胞 - 細胞相互作用網絡提出了新的見解思路，以CD8陽性T細胞作為研究線索觀察到CD8細胞邊緣浸潤的失調，進一步為腫瘤免疫的相關機制研究拓展了研究領域的廣度。除此之外，針對NK細胞、GZMA 細胞和 GSDMB 細胞也均進行了原位精準空間定量分析，為后續的深入研究奠定了扎實的基礎。在這些研究中，在切片原位的多重免疫組化標記，針對不同表型細胞的蛋白表達及細胞分布分析，也都是利用TissueFAXS Cytometry技術來進行的個體化精準定量分析。

Figure 1 GZMA+細胞和GSDMB+細胞由CD8+T細胞分泌。

A：對照組和黑色素瘤組織的多色免疫熒光染色圖像。DAPI(藍色)、CD8(粉色)、GZMA(綠色)和GSDMB(紅色)。

B：CD8+GZMA+共定位和CD8+GSDMB+共定位散點圖。

Figure 2 NK T細胞分泌GZMA+細胞和GSDMB+細胞

A：對照組和黑色素瘤組織的多色免疫熒光染色圖像。DAPI(藍色)、CD57(粉色)、GZMA(綠色)和GSDMB(紅色)。

B：CD8+GZMA+共定位，CD8+GSDMB+共定位，CD57+GZMA+和CD57+GSDMB+散點圖。

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