紅細胞生成島（Erythroblastic islands，EBIs）是骨髓中的特定結構，包括中央巨噬細胞，在終末分化的不同階段被紅細胞前體包圍。但在腫瘤中從未被發現具有功能。肝母細胞瘤(HB)是兒科最常見的肝臟惡性腫瘤，需要更有效、更安全的治療方法來預防疾病進展和并發癥對幼兒的終生影響。然而，由于缺乏對腫瘤微環境的全面了解，此類療法的開發受到阻礙。

2023年5月16日，中山大學附屬第一醫院精準醫學研究與小兒外科聯合在Cell Reports Medicine 上發表了題為“Intratumoral erythroblastic islands restrain anti-tumor immunity in hepatoblastoma”的研究論文。本研究提供了乙肝免疫微環境的單細胞圖譜，確定了EBI在調節免疫抑制的腫瘤免疫微環境中的作用。

通過對13個未接受治療的HB患者進行單細胞RNA測序，我們發現了一種免疫特征，由VCAM1+巨噬細胞和紅細胞形成的EBIs的異常積累，且與HB的生存率呈負相關。紅系細胞通過LGALS9/TIM3軸抑制樹突狀細胞(DC)的功能，導致抗腫瘤T細胞免疫應答受損。但是，TIM3阻斷緩解了紅細胞對DCs的抑制作用。該研究提供了一種由腫瘤內EBIs介導的免疫逃逸機制，并提出TIM3作為HB的一個有前途的治療靶點。該結果可能有助于開發更安全、更有效的免疫療法來治療患有乙肝的兒童。

實驗部分

1 本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光譜組織掃描定量分析系統HB組織樣本進行多色熒光圖像采集。利用光譜庫進行光譜拆分，獲得單通道熒光信號。DAPI通道識別單細胞。以細胞核為中心，根據每個蛋白的染**況設定距離半徑，得到每個蛋白的熒光染色信號。然后，根據每個通道的染**況設定閾值，劃分陽性細胞群，計數陽性細胞。

2 利用Tissue Cytometry技術對數據進行空間共定位分析。計算感興趣的細胞之間的距離和每對細胞表型的相互鄰居的數量(最大距離為25 mm)。為了調節紅系細胞的密度，我們計算半徑25 mm范圍內LGALS9+紅系細胞周圍TIM3+DC的密度，然后除以腫瘤內LGALS9+紅系細胞的密度。從而得到每個LGALS9+紅系細胞附近TIM3+DC的數量。

3 Flow Cytometry技術專注于對液流中單個細胞進行精準的量化分析，但是無法獲得組織原位的細胞形態以及細胞分布關系；Tissue Cytometry技術基于全景多光譜成像的技術原理，可以獲得組織原位單細胞量化分析的同時，不但分析目標精確到細胞核/質等亞細胞水平的精度，更可以通過其與腫瘤的空間分布關系，對目標在真實生物體中的位置作用進行量化分析。

本文作者聯合使用Flow Cytometry技術和Tissue Cytometry技術，針對體外/體內的目標紅系細胞分別進行了細胞數量與熒光強度的對比分析，尤其是在Tissue Cytometry技術中，更獲得了TME原位空間表型分析數據，結合TSA多重免疫熒光技術，對LGALS9 +紅系細胞和 TIM3 + DC之間的空間作用關系進行了探索，發現了一種以EBI異常積累為特征的免疫環境的存在，為后續進一步實驗打下了堅實基礎。

Fig 1 VCAM1+巨噬細胞與紅系細胞形成EBIs

(F) 乙肝腫瘤的多重免疫熒光圖像，箭頭指向EBI結構，由CD68+VCAM1+巨噬細胞和周圍的CD45-Gypa+紅系細胞組成。

(G) HB腫瘤及鄰近肝臟樣本中紅系細胞與VCAM1+巨噬細胞的距離(左)和紅系細胞與VCAM1+巨噬細胞的比例(≤25 um)。

Fig 2 腫瘤內紅系細胞通過LGALS9/TIM3軸抑制DC的抗腫瘤功能

(D) HB腫瘤的多色免疫熒光染色圖像，顯示紅系細胞(LGALS9+Gypa+，用紅色箭頭標記)與DC(CD11c+TIM3+，用橙色箭頭標記)之間的相互作用。