腋窩淋巴結（LNs）是乳腺癌（BC）的主要轉移部位。然而，轉移性淋巴結（mLNs）內腫瘤細胞和免疫細胞之間的相互作用仍然不清楚。在本文的研究中，我們探討了mLNs內CD24hiCD27+調節性B細胞（Bregs）對BC細胞耐藥性的影響。
2023年10月11日，浙江大學醫學院附屬第二醫院乳腺外科在Clinical Cancer Research雜志上發表了題為CD24hiCD27+Bregs within metastatic lymph nodes promote multi-drug resistance in breast cancer的研究論文。研究揭示了CD24hiCD27+Bregs通過與mLNs內BC細胞相互作用促進耐藥性的關鍵作用，為BC患者使用化療-免疫治療聯合策略提供了新的證據。
實驗收集了接受標準新輔助治療（NAT）的BC患者的mLN樣本，并通過多色免疫熒光染色分析了CD24hiCD27+Bregs的空間分布特征。通過體外實驗評價了CD24hiCD27+ Bregs對BC細胞耐藥性的影響。使用帶有mLNs的小鼠模型評價了阻斷Bregs和BC之間相互作用以改善mLNs內腫瘤消退的策略。在接受NAT的BC患者中，活化的CD24hiCD27+Bregs與mLN內殘留的腫瘤細胞之間存在密切的空間相關性。
機制上，CD24hiCD27+ Bregs通過分泌IL-6和TNF-a顯著增強了BC細胞多藥耐藥性和類干細胞特征。更重要的是，BC細胞通過CD40L-和PD-L1依賴的近端信號進一步促進了CD24hiCD27+Bregs的激活，形成了一個正反饋模式。PD-L1阻斷顯著減弱了由CD24hiCD27+ Bregs誘導的BC細胞耐藥性，并且在化療中加入抗PD-L1抗體可以改善mLNs內腫瘤細胞消退。
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實驗部分
本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光譜組織掃描定量分析系統對來自7個不同患者的BC腫瘤和對照LN的組織切片進行多色免疫熒光圖像采集。
Panel 1 : pan-CK，CD19，IL-10，DAPI
Panel 2: pan-CK，CD19, CD24, CD27,IL-10,DAPI
Panel 3 :pan-CK, CD19, TNF-α, IL-6, IL-10, DAPI
為了研究數據的可靠性，本文作者首先通過Tissue Cytometry技術對B細胞分泌IL-10的單細胞表達水平進行了精準定量分析，明確了mLN 中存活的標準 NAT 的殘留腫瘤細胞密切相關。為了實現這一目的，免疫熒光染色使用了Panel1：Panel 1 : pan-CK，CD19，IL-10，DAPI。
接下來，為了探討免疫細胞的活化狀態，研究者以在乳腺癌 mLN中的CD24hiCD27+ Bregs作為研究目標，不但對其單細胞表達水平進行了量化，還對其在腫瘤微環境中的分布進行了空間作用關系分析。研究發現，在富含B細胞的淋巴濾泡被破壞， B細胞更多地分布在轉移性腫瘤巢周圍。在這部分同樣借助Tissue Cytometry技術，并使用了Panel2：Panel 2: pan-CK，CD19, CD24, CD27,IL-10,DAPI
在下一步中，研究者對表達IL-10 的B細胞進行研究的基礎上，結合表達IL-6和/或TNF-a的細胞亞型，對其與殘留腫瘤負荷的關系進行了研究，發現結果呈正相關，從而證明CD24hiCD27+ Breg衍生細胞因子的效應，即TNF-和IL-6，而不是IL-10，是BC細胞干性和多藥耐藥性的原因。在這部分研究中使用了Tissue Cytometry技術進行分析，使用Panel組合3：pan-CK, CD19, TNF-α, IL-6, IL-10, DAPI
雖然本文大量使用了流式細胞技術與轉錄組技術對細胞表型及細胞表達水平進行了量化分析，但是在關鍵數據上，都建立了使用Tissue Cytometry技術作為原位校驗方法的驗證標準。相比傳統的研究思路，這樣獲得的數據不但更加全面，并且從單細胞蛋白表達層面對空間分布關系進行研究，是最能反映生物體真實情況的研究水平。
在空間距離分析方面，考慮到腫瘤微環境中作用細胞的分布特性，距離腫瘤邊界越近相對作用越顯著，所以文章作者在考慮微環境作用關系分析方面，在不同測試方案后，采用了距離梯度0-25μm，25-50μm，50-100μm這三個范圍，既細化了腫瘤微環境研究的精準性，同時也兼顧遠端細胞的數據分析考量。
Figure 1 CD24hiCD27+Bregs是LNS中最主要的B細胞亞群，位于MLN中非常接近腫瘤細胞處。
A: 部分應答（PR，n=17）和進展的轉移性淋巴結（MLN）患者的多色免疫熒光圖像IL-10（黃色），CD19（紅色），pan-CK（綠色）和DAPI（紫色）。根據IL-10和CD19表達的多色免疫熒光圖像分析，定量不同藥物反應的mLN中IL-10+CD 19+的細胞占比。
F: 在BC患者的非MLN和MLN中的IL-10(黃色)、CD19(紅色)、CD24(天藍色)、CD27(紫紅色)、pan-CK(綠色)和DAPI(紫色)染色的多色免疫熒光圖像。定量分析IL-10+B細胞中IL-10+CD24hiCD27+B細胞中IL-10+CD24hiCD27+B細胞的百分比。
G: BC患者外周血中IL-10+CD24hiCD27+ B細胞中pan-CK+周圍的IL-10+CD24hiCD27+ B細胞占比。
Figure 2 F: 不同處理組小鼠骨髓單個核細胞pan-CK、CD19、IL-10、腫瘤壞死因子-α、IL-6的多色免疫熒光圖像。不同處理組小鼠骨髓單個核細胞中IL-10+B細胞占B細胞百分比的統計分析。