腋窩淋巴結(jié)（LNs）是乳腺癌（BC）的主要轉(zhuǎn)移部位。然而，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)（mLNs）內(nèi)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用仍然不清楚。在本文的研究中，我們探討了mLNs內(nèi)CD24hiCD27+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Bregs）對BC細(xì)胞耐藥性的影響。
2023年10月11日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院乳腺外科在Clinical Cancer Research雜志上發(fā)表了題為CD24hiCD27+Bregs within metastatic lymph nodes promote multi-drug resistance in breast cancer的研究論文。研究揭示了CD24hiCD27+Bregs通過與mLNs內(nèi)BC細(xì)胞相互作用促進(jìn)耐藥性的關(guān)鍵作用，為BC患者使用化療-免疫治療聯(lián)合策略提供了新的證據(jù)。
實驗收集了接受標(biāo)準(zhǔn)新輔助治療（NAT）的BC患者的mLN樣本，并通過多色免疫熒光染色分析了CD24hiCD27+Bregs的空間分布特征。通過體外實驗評價了CD24hiCD27+ Bregs對BC細(xì)胞耐藥性的影響。使用帶有mLNs的小鼠模型評價了阻斷Bregs和BC之間相互作用以改善mLNs內(nèi)腫瘤消退的策略。在接受NAT的BC患者中，活化的CD24hiCD27+Bregs與mLN內(nèi)殘留的腫瘤細(xì)胞之間存在密切的空間相關(guān)性。
機制上，CD24hiCD27+ Bregs通過分泌IL-6和TNF-a顯著增強了BC細(xì)胞多藥耐藥性和類干細(xì)胞特征。更重要的是，BC細(xì)胞通過CD40L-和PD-L1依賴的近端信號進(jìn)一步促進(jìn)了CD24hiCD27+Bregs的激活，形成了一個正反饋模式。PD-L1阻斷顯著減弱了由CD24hiCD27+ Bregs誘導(dǎo)的BC細(xì)胞耐藥性，并且在化療中加入抗PD-L1抗體可以改善mLNs內(nèi)腫瘤細(xì)胞消退。
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實驗部分
本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光譜組織掃描定量分析系統(tǒng)對來自7個不同患者的BC腫瘤和對照LN的組織切片進(jìn)行多色免疫熒光圖像采集。
Panel 1 : pan-CK，CD19，IL-10，DAPI
Panel 2: pan-CK，CD19, CD24, CD27,IL-10,DAPI
Panel 3 :pan-CK, CD19, TNF-α, IL-6, IL-10, DAPI
為了研究數(shù)據(jù)的可靠性，本文作者首先通過Tissue Cytometry技術(shù)對B細(xì)胞分泌IL-10的單細(xì)胞表達(dá)水平進(jìn)行了精準(zhǔn)定量分析，明確了mLN 中存活的標(biāo)準(zhǔn) NAT 的殘留腫瘤細(xì)胞密切相關(guān)。為了實現(xiàn)這一目的，免疫熒光染色使用了Panel1：Panel 1 : pan-CK，CD19，IL-10，DAPI。
接下來，為了探討免疫細(xì)胞的活化狀態(tài)，研究者以在乳腺癌 mLN中的CD24hiCD27+ Bregs作為研究目標(biāo)，不但對其單細(xì)胞表達(dá)水平進(jìn)行了量化，還對其在腫瘤微環(huán)境中的分布進(jìn)行了空間作用關(guān)系分析。研究發(fā)現(xiàn)，在富含B細(xì)胞的淋巴濾泡被破壞， B細(xì)胞更多地分布在轉(zhuǎn)移性腫瘤巢周圍。在這部分同樣借助Tissue Cytometry技術(shù)，并使用了Panel2：Panel 2: pan-CK，CD19, CD24, CD27,IL-10,DAPI
在下一步中，研究者對表達(dá)IL-10 的B細(xì)胞進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合表達(dá)IL-6和/或TNF-a的細(xì)胞亞型，對其與殘留腫瘤負(fù)荷的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)果呈正相關(guān)，從而證明CD24hiCD27+ Breg衍生細(xì)胞因子的效應(yīng)，即TNF-和IL-6，而不是IL-10，是BC細(xì)胞干性和多藥耐藥性的原因。在這部分研究中使用了Tissue Cytometry技術(shù)進(jìn)行分析，使用Panel組合3：pan-CK, CD19, TNF-α, IL-6, IL-10, DAPI
雖然本文大量使用了流式細(xì)胞技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對細(xì)胞表型及細(xì)胞表達(dá)水平進(jìn)行了量化分析，但是在關(guān)鍵數(shù)據(jù)上，都建立了使用Tissue Cytometry技術(shù)作為原位校驗方法的驗證標(biāo)準(zhǔn)。相比傳統(tǒng)的研究思路，這樣獲得的數(shù)據(jù)不但更加全面，并且從單細(xì)胞蛋白表達(dá)層面對空間分布關(guān)系進(jìn)行研究，是最能反映生物體真實情況的研究水平。
在空間距離分析方面，考慮到腫瘤微環(huán)境中作用細(xì)胞的分布特性，距離腫瘤邊界越近相對作用越顯著，所以文章作者在考慮微環(huán)境作用關(guān)系分析方面，在不同測試方案后，采用了距離梯度0-25μm，25-50μm，50-100μm這三個范圍，既細(xì)化了腫瘤微環(huán)境研究的精準(zhǔn)性，同時也兼顧遠(yuǎn)端細(xì)胞的數(shù)據(jù)分析考量。
Figure 1 CD24hiCD27+Bregs是LNS中最主要的B細(xì)胞亞群，位于MLN中非常接近腫瘤細(xì)胞處。
A: 部分應(yīng)答（PR，n=17）和進(jìn)展的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)（MLN）患者的多色免疫熒光圖像IL-10（黃色），CD19（紅色），pan-CK（綠色）和DAPI（紫色）。根據(jù)IL-10和CD19表達(dá)的多色免疫熒光圖像分析，定量不同藥物反應(yīng)的mLN中IL-10+CD 19+的細(xì)胞占比。
F: 在BC患者的非MLN和MLN中的IL-10(黃色)、CD19(紅色)、CD24(天藍(lán)色)、CD27(紫紅色)、pan-CK(綠色)和DAPI(紫色)染色的多色免疫熒光圖像。定量分析IL-10+B細(xì)胞中IL-10+CD24hiCD27+B細(xì)胞中IL-10+CD24hiCD27+B細(xì)胞的百分比。
G: BC患者外周血中IL-10+CD24hiCD27+ B細(xì)胞中pan-CK+周圍的IL-10+CD24hiCD27+ B細(xì)胞占比。
Figure 2 F: 不同處理組小鼠骨髓單個核細(xì)胞pan-CK、CD19、IL-10、腫瘤壞死因子-α、IL-6的多色免疫熒光圖像。不同處理組小鼠骨髓單個核細(xì)胞中IL-10+B細(xì)胞占B細(xì)胞百分比的統(tǒng)計分析。