N6-甲基腺嘌呤（m6A）在腎臟生理和疾病進展中具有重要作用，但其在腎纖維化中的功能和機制尚需全面和深入地探索。因此，本研究將探討關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子介導的m6A修飾在腎纖維化中的功能和潛在機制，并尋找有前景的抗腎纖維化藥物。
2023年7月，安徽醫(yī)科大學藥學院孟曉明教授團隊在Clinical And Translational Medicine雜志上發(fā)表題為
Genetic and pharmacological inhibition of METTL3 alleviates renal fibrosis by
reducing EVL m6A modification through an IGF2BP2-dependent mechanism 的研究論文。
使用人類和小鼠的腎臟組織以及HK-2細胞作為研究對象，利用Western blotting、定量實時聚合酶鏈反應等方法分析腎纖維化中m6A修飾和調(diào)節(jié)因子的蛋白質(zhì)和RNA水平。采用甲基化RNA免疫共沉淀測序和RNA測序結(jié)合METTL3條件基因敲除小鼠，探索METTL3的功能和潛在靶點。
通過基因沉默和過表達結(jié)合RNA免疫沉淀的方法，研究METTL3調(diào)節(jié)EVL樣蛋白的潛在機制的m6A修飾，從而促進腎纖維化。通過分子對接和虛擬篩選結(jié)合體外和體內(nèi)實驗，篩選出有前景的中藥單體，并探索它們對METTL3/EVL m6A軸的調(diào)節(jié)機制、抗腎纖維化作用。
結(jié)果證明METTL3和m6A修飾在纖維化腎臟的腎小管區(qū)域和HK-2細胞中均被高度激活。上調(diào)的METTL3增強了EVL mRNA的m6A修飾，通過胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白2（IGF2BP2）依賴性機制提高了其穩(wěn)定性和表達。高表達的EVL與Smad7結(jié)合，抑制了Smad7對轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β1）/Smad3信號轉(zhuǎn)導的抑制作用，反過來促進了腎纖維化的進展。基于METTL3蛋白結(jié)構(gòu)的分子對接和虛擬篩選，從中藥單體數(shù)據(jù)庫中篩選出一種名為異連翹苷的中藥單體，它能夠抑制METTL3活性以及METTL3/EVL m6A軸，表明它是一種有前途的抗腎纖維化藥物。
總之，過度激活的METTL3/EVL m6A軸是腎纖維化治療的潛在靶點，通過藥理學方法抑制METTL3活性的異連翹苷提示它是一種有前景的抗腎纖維化藥物。
實驗部分
表觀遺傳修飾可以實現(xiàn)在不改變核苷酸序列的前提下對基因組功能進行調(diào)節(jié)，相對通過測序手段探索細胞表型的研究方法，其結(jié)果更可以反應真實細胞的功能和狀態(tài)，但是也受限于研究技術(shù)手段，針對研究結(jié)果的可靠性一直是需要認真探討的難點之一。
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Tissue Cytometry技術(shù)是一項在生命科學研究領(lǐng)域適用廣泛的組織原位定量分析技術(shù)。本文作者使用了蛋白印跡、MeRIP-seq、RNA免疫沉淀、共免疫沉淀、細胞熱變位實驗等技術(shù)，多角度揭示了過度激活的METTL3/EVL m6A軸是腎纖維化治療的潛在靶點，通過藥物抑制METTL3的活性是一種有前景的抗腎纖維化策略。
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為了提高結(jié)果的可信度，包括人組織樣本、動物樣本、細胞實驗等部分，均借助了Tissue Cytometry技術(shù)針對藥物作用的機制機理進行了深度探索，并利用其標準化程度高，數(shù)據(jù)驗證客觀準確的特點，針對每一步數(shù)據(jù)結(jié)果進行了組織水平的驗證，為今后的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。
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針對與藥物機制研發(fā)、藥物靶點篩選等深入探索研究，Tissue Cytometry技術(shù)更進一步提供了一體化的微環(huán)境免疫多色標記解決方案，可以實現(xiàn)組織原位10色蛋白染色標記。該方案在類流式單細胞分析方法的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了整套免疫微環(huán)境大數(shù)據(jù)深度挖掘體系，擁有成熟的多標記染色試劑盒體系、大尺寸高倍率全自動連續(xù)光譜全景成像技術(shù)、可原位追溯的大數(shù)據(jù)AI深度空間量化分析功能。在分析深度上，可以任意針對微環(huán)境范圍、數(shù)量進行數(shù)據(jù)集指定，可視化的原位不同表型的多標記單細胞分布定量可以提供海量的大數(shù)據(jù)分析；一體化方案的優(yōu)勢在于簡化了數(shù)據(jù)的流轉(zhuǎn)環(huán)節(jié)，并允許用戶根據(jù)應用領(lǐng)域定制專屬APP，實現(xiàn)全自動的無人值守，大大提高了組織原位數(shù)據(jù)輸出操作的效率和可靠性。
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Figure 1 人腎組織、小鼠模型和腎小管上皮細胞對促纖維化刺激的反應中，甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(METTL3)和N6-甲基腺苷(M6A)修飾的F I G U R E 1水平增加。
（C）UUO小鼠腎組織中M6A和LTL的代表性免疫熒光染色。
（I）ON患者腎組織中METTL3和LTL的代表性免疫熒光染色。
（J）ON患者腎組織中M6A修飾的代表性免疫熒光染色
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Figure 2 Ena/Vasp樣蛋白(EVL)是甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(METTL3)介導的N6-甲基腺苷(M6A)修飾腎纖維化的潛在靶基因。
（C）METTL3條件性基因敲除(CKO)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎組織中EVL和LTL的代表性免疫熒光染色。
（E）（F）免疫熒光染色圖像觀察METTL3基因敲除對轉(zhuǎn)化生長因子-β-1和缺氧-復氧(H/R)誘導的HK-2細胞EVL表達的影響。
Figure 3 甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(METTL3)以胰島素樣生長因子2mRNA結(jié)合蛋白2(IGF2BP2)依賴的方式直接促進N6-甲基腺苷(M6A)修飾和Ena/Vasp樣(EVL)mRNA的穩(wěn)定性。
（J）（K）代表性的免疫熒光染色圖像分析IGF2BP2在轉(zhuǎn)化生長因子-β-1和H/R處理的HK-2細胞(n=3)中的表達。
Figure 4 沉默Ena/Vasp樣蛋白可能通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β-1/Smad3機制減輕轉(zhuǎn)化生長因子-β-1誘導的HK-2細胞纖維化反應。
（B）轉(zhuǎn)化生長因子-β-1抑制血管內(nèi)皮生長因子抑制的HK-2細胞纖維化標志物的代表性免疫熒光染色分析。
（D）轉(zhuǎn)化生長因子-β-1基因敲除的HK-2細胞中p-Smad3的典型免疫熒光染色分析。