期刊：Science China-Life Sciences
影響因子：8.0
成簇的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列 （CRISPR）/Cas9 系統(tǒng)是編輯哺乳動(dòng)物基因組的革命性方法。隨著慢病毒遞送方法的發(fā)展，CRISPR 篩選技術(shù)出現(xiàn)，并實(shí)現(xiàn)了全基因組敲除的低成本方式。然而，CRISPR 篩選只能分析具有非常不同表型的基因，例如那些顯著影響細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，或者那些可以用抗體或熒光蛋白直接檢測(cè)到的基因。
2016 年，開發(fā)了一種稱為單細(xì)胞 CRISPR 篩選 （scCRISPR-seq） 的新技術(shù)，該技術(shù)將 CRISPR 擾動(dòng)和單細(xì)胞測(cè)序相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模單細(xì)胞分辨率的混合遺傳篩選。scCRISPR-seq 的關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新是慢病毒載體的創(chuàng)造性設(shè)計(jì)，稱為 Perturb-seq 載體，允許從測(cè)序中鑒定每個(gè)細(xì)胞中的 sgRNA（圖 16A）。scCRISPR-seq 可以促進(jìn)復(fù)雜調(diào)控機(jī)制和異質(zhì)細(xì)胞群的高通量功能解剖。
在本章中，我們將分四個(gè)不同的部分全面回顧 scCRISPR-seq。首先，我們將介紹 scCRISPR-seq 每個(gè)類別中的代表性技術(shù)。其次，我們將深入研究專門為分析 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)開發(fā)的主要工具。第三，我們將探索 scCRISPR-seq 的重要應(yīng)用。最后，我們將得出結(jié)論并參與與 scCRISPR-seq 相關(guān)的局限性和未來趨勢(shì)的討論。
scCRISPR-seq 平臺(tái)類別
目前，已經(jīng)出現(xiàn)了許多替代的 scCRISPR-seq 平臺(tái)（表 5）。基于 scCRISPR-seq 的集成組學(xué)方法，這些平臺(tái)可分為三大類：基于轉(zhuǎn)錄組的 scCRISPR-seq、基于表觀基因組的 scCRISPR-seq 和多模態(tài) scCRISPR-seq。
基于轉(zhuǎn)錄組的 scCRISPR-seq
主要的 scCRISPR-seq 平臺(tái)是基于轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用程序，將 CRISPR 篩選與單細(xì)胞 RNA-seq 相結(jié)合。對(duì)于基于轉(zhuǎn)錄組的 scCRISPR-seq，Perturbseq 載體通常由單向?qū)?RNA （sgRNA）、細(xì)胞條形碼 （CBC）、基因條形碼 （GBC） 和 UMI 組成，例如 Perturb-seq和 CRISPseq。在 Perturb-seq 載體中，sgRNA 用于指導(dǎo) Cas9 核酸酶在目標(biāo)基因組區(qū)域誘導(dǎo)雙鏈斷裂，CBC 用于標(biāo)記每個(gè)細(xì)胞，而 GBC 用于標(biāo)記每個(gè) sgRNA，UMI 用于標(biāo)記每個(gè)轉(zhuǎn)錄本。Perutrb-seq 和 CRISP-seq 是第一個(gè)開發(fā)的 scCRISPR-seq 平臺(tái)。這些方法涉及 Perturb-seq 載體的復(fù)雜構(gòu)建，包括復(fù)雜的克隆策略，有時(shí)還需要 gRNA 間隔區(qū)與其條形碼的解耦，這限制了它們的多功能性。CROPseq 優(yōu)化了 Perturbseq 載體的設(shè)計(jì)，通過向 Perturb-seq 載體添加 Poly-A 尾部來檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)的 sgRNA 與 mRNA 偶聯(lián)，這大大降低了 scCRISPR-seq 的復(fù)雜性和成本。然而，Hill 等人。（2018） 表明，由于這些研究的 Perturb-seq 載體設(shè)計(jì)，現(xiàn)有研究的慢病毒交換率僅為 50% 左右。因此，他們通過將向?qū)?RNA 作為條形碼來優(yōu)化 CROP-seq 載體設(shè)計(jì)，將交換率提高到 94%。由于 Perturb-seq 載體設(shè)計(jì)的限制，Perturb-seq 和 CRISP-seq 的每個(gè)慢病毒載體只能向細(xì)胞遞送單個(gè)編碼的 sgRNA，而 CROP-seq 能夠?qū)⒊蓪?duì)的 sgRNA 遞送到細(xì)胞。也就是說，它們都與多個(gè) sgRNA 的遞送不相容。為了解決這個(gè)問題，Replogle 等人。（2020） 設(shè)計(jì)了直接捕獲 Perturb-seq，其中表達(dá)的 sgRNA 與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組一起測(cè)序，并能夠遞送多個(gè) sgRNA。直接捕獲 Perturbseq 對(duì)于遺傳相互作用的機(jī)制解剖特別有價(jià)值。它進(jìn)一步降低了 Perturb-seq 實(shí)驗(yàn)的成本。Direct-seq 具有與直接捕獲 Perturb-seq 類似的功能，可實(shí)現(xiàn) CRISPR 擾動(dòng)及其轉(zhuǎn)錄讀數(shù)一起分析，并支持多個(gè) sgRNA 的遞送。2022 年，Replogle 等人引入了基因組規(guī)模的 Perturb-seq 方法。（2022 年），能夠?qū)τ绊?9,867 個(gè)基因的基因組規(guī)模遺傳擾動(dòng)進(jìn)行公正和全面的分析。這一突破促進(jìn)了系統(tǒng)的基因功能分配和復(fù)雜細(xì)胞表型的探索。最近，利塔爾.（2023） 開發(fā)了 CRISPR-人類類器官-單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 （CHOOSE） 系統(tǒng)。這種創(chuàng)新系統(tǒng)能夠進(jìn)行遺傳破壞和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，用于混合功能喪失篩選嵌合類器官。然而，上述所有 scCRISPR-seq 平臺(tái)都僅限于體外應(yīng)用。相比之下，體內(nèi)測(cè)定更具吸引力，因?yàn)樗鼈兣c真實(shí)的有機(jī)條件更相似。因此開發(fā)了體內(nèi) Perturb-seq，這是 Perturb-seq 方案的一種變體，涉及在體內(nèi)進(jìn)行的合并擾動(dòng)。此外，PoKI-seq （Roth et.， 2020） 已經(jīng)證明了體內(nèi)研究重編程 T 細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤的免疫反應(yīng)的可行性。最近，Santinha 等人。（2023） 開發(fā)了腺相關(guān)病毒 （AAV） 介導(dǎo)的直接體內(nèi)單細(xì)胞 CRISPR 篩選，稱為 AAV-Perturb-seq，一種可用于體內(nèi)遺傳擾動(dòng)轉(zhuǎn)錄連鎖分析和表型分析的可調(diào)且廣泛適用的方法。
基于表觀基因組的 scCRISPR-seq
基于表觀基因組的 scCRISPR-seq 除了轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用外，還有基于表觀遺傳學(xué)的 scCRISPR-seq 平臺(tái)。2019 年開發(fā)了 Perturb-ATAC，這是一種將 CRISPR 干擾或敲除與單細(xì)胞染色質(zhì)可及性分析相結(jié)合的方法，該方法基于通過測(cè)序檢測(cè)轉(zhuǎn)座酶可及性染色質(zhì) （ATAC-seq） 同時(shí)檢測(cè) CRISPR 向?qū)?RNA 和開放染色質(zhì)位點(diǎn)。他們應(yīng)用這種方法來確定各種反式調(diào)控因子的作用，包括 TFs、染色質(zhì)修飾劑以及人類和病毒 ncRNA，這可能有助于剖析順式調(diào)控元件和 ncRNA 轉(zhuǎn)錄本已被證明對(duì)基因表達(dá)有影響的基因座（Cho 等人，2018b;Engreitz 等人，2016 年;Rubin 等人，2019 年）。Perturb-ATAC 將 scCRISPR-seq 研究擴(kuò)展到表觀基因組領(lǐng)域，使 scCRISPR-seq 更強(qiáng)大、應(yīng)用更廣泛。然而，Perturb-ATAC 受到高成本和低吞吐量的限制。為了應(yīng)對(duì)這一限制，開發(fā)了 Spear-ATAC（Pierce 等人，2021 年）以實(shí)現(xiàn)顯著更高的細(xì)胞通量和大幅降低成本，提供了更實(shí)用的替代方案。此外，CRISPR-sciATAC （Liscovitch-Braueret al.， 2021） 顯示出與 Spear-ATAC 相似的細(xì)胞通量和成本。然而，它對(duì)染色質(zhì)可及性的細(xì)微變化表現(xiàn)出有限的敏感性。
多模態(tài) scCRISPR-seq
多模式單細(xì)胞檢測(cè)提供了異質(zhì)細(xì)胞群的高分辨率快照，但上述 scCRISPR-seq 平臺(tái)都僅限于一種模式，例如轉(zhuǎn)錄組或表觀基因組。因此，為了將該技術(shù)同時(shí)應(yīng)用于多組學(xué)，開發(fā)了多模態(tài) scCRISPR-seq。Xie et al. （2017） 通過索引 CRISPR 測(cè)序 （Mosaic-seq） 開發(fā)了Mosaic單細(xì)胞分析，以擾亂增強(qiáng)子并共同測(cè)量每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組及其誘導(dǎo)的 sgRNA。Mosaic-seq 提供了一種新穎的工具，以基于 inper擾動(dòng)的方式詢問非編碼基因的功能。此外，Mimitou 等人。（2019） 通過測(cè)序開發(fā)了擴(kuò)展的 CRISPR 兼容轉(zhuǎn)錄組和表位細(xì)胞索引 （ECCITE-seq），它允許同時(shí)檢測(cè)來自每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)、克隆型和 CRISPR 擾動(dòng)。通過構(gòu)建 ECCITEseq 抗體的 a49 標(biāo)記面板來分析人外周血單核細(xì)胞 （PBMC），他們恢復(fù)了許多重要結(jié)果（Fanok等人，2018 年;Stoeckius 等人，2017 年），證明了 ECCITE-seq 結(jié)合免疫表型、克隆型和轉(zhuǎn)錄組信息的能力。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠表征基因表達(dá)譜，同時(shí)保留有關(guān)空間組織背景的信息，這為生物學(xué)的不同領(lǐng)域提供了新的見解，例如神經(jīng)科學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和癌癥研究（Moses 和 Pachter，2022）（參見下面的空間部分）。最近，開發(fā)了一種新的多模態(tài) scCRISPR-seq，稱為 Perturb-map （Dhainaut et.， 2022），以通過成像和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)實(shí)現(xiàn) CRISPR 篩選原位的多模態(tài)表型分析。Perturb-map 基于蛋白質(zhì)條形碼 （Pro-Code） 系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用幾個(gè)線性表位的三重體組合來創(chuàng)建更高階的唯一條形碼集（Wroblewska 等人，2018 年）。這些獨(dú)特的條形碼可以標(biāo)記表達(dá)不同 CRISPR gRNA 的細(xì)胞。需要注意的是，Perturb-map 是唯一能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi) CRISPR 篩選與空間轉(zhuǎn)錄組相結(jié)合的 scCRISPR-seq 平臺(tái)，特別適用于鑒定腫瘤組成、組織和免疫的遺傳決定因素。Perturb-map 基于蛋白質(zhì)條形碼 （Pro-Code） 系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用幾個(gè)線性表位的三重體組合來創(chuàng)建更高階的唯一條形碼集（Wroblewska 等人，2018 年）。這些獨(dú)特的條形碼可以標(biāo)記表達(dá)不同 CRISPR gRNA 的細(xì)胞。需要注意的是，Perturb-map 是唯一能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi) CRISPR 篩選與空間轉(zhuǎn)錄組相結(jié)合的 scCRISPR-seq 平臺(tái)，特別適用于鑒定腫瘤組成、組織和免疫的遺傳決定因素。Dhainaut 等人。（2022） 將 Perturb-map 應(yīng)用于 TME 的研究。他們?cè)诜伟┬∈竽Ｐ椭星贸?35 個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)敲除 Tgfbr2 可以促進(jìn) TME 重塑和免疫排斥。
scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)分析工具
scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)包含豐富的擾動(dòng)信息，這對(duì)于在單細(xì)胞水平上探索基因型和表型之間的關(guān)聯(lián)具有天然的優(yōu)勢(shì)。例如，通過將 Perturb-seq 應(yīng)用于 K562 細(xì)胞系，Adamson 等人。（2016） 表明，PERK 的擾動(dòng)對(duì)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)的影響比 ATF6 和 IRE1α 更大。Datlinger 等人 （2017） 在用 CROP-seq 激活 T 細(xì)胞受體 （TCR） 的條件下擾動(dòng)了 Jurkat 細(xì)胞系中的 23 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn) LCK 、 ZAP70 和 LAT 的敲除對(duì) TCR 激活信號(hào)傳導(dǎo)有很強(qiáng)的負(fù)面影響。然而，由于其固有的噪聲，scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)的分析是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。因此，已經(jīng)開發(fā)了幾種生物信息學(xué)工具來幫助分析 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)（支持信息中的表 S12）。通常，這些 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)分析工具側(cè)重于三個(gè)部分（圖 16B）：（i） 數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括質(zhì)量控制、歸一化和差異表達(dá)基因檢測(cè)，例如 MIMOSCA 、MUSIC和 SCREE 。（ii） 數(shù)據(jù)去噪，包括單細(xì)胞插補(bǔ)、轉(zhuǎn)義細(xì)胞過濾和復(fù)合因子分解，例如 MUSIC、mixscape 和 SCREE 。（iii） 功能分析，包括確定每個(gè)擾動(dòng)影響的優(yōu)先級(jí)，確定每個(gè)擾動(dòng)的功能，推斷調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和基因相互作用，例如 MUSIC、Normalisr、scMAGeCK、Pando和 GEARS。具體來說，LRICA是通過低秩矩陣分解來解碼數(shù)據(jù)的驅(qū)動(dòng)信號(hào)/分量。MIMOSCA是一種計(jì)算sg RNA與每個(gè)基因之間關(guān)系的計(jì)算框架。LRICA 和 MIMOSCA 是作為原型開發(fā)的，沒有可執(zhí)行且用戶友好的實(shí)現(xiàn)。因此，Duan 等人。（2019） 開發(fā)了 MUSIC，這是一個(gè)通用的計(jì)算框架，用于通過主題建模評(píng)估每個(gè)擾動(dòng)的影響，它最初出現(xiàn)在機(jī)器學(xué)習(xí)和自然語言處理社區(qū)或特定文檔集中的潛在主題發(fā)現(xiàn)中。MUSIC 將基因型表型與對(duì)大量噪聲的耐受性聯(lián)系起來，并從三個(gè)角度分析 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)，即優(yōu)先考慮基因擾動(dòng)效應(yīng)作為整體擾動(dòng)效應(yīng)、非功能性主題特異性方式，以及量化不同擾動(dòng)之間的相關(guān)性。scMAGeCK 也是分析 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)的框架，它是從 MAGeCK 擴(kuò)展而來的。scMAGeCK 包括兩個(gè)模塊，scMAGeCK-RRA 和 scMAGECK-LR，其中 scMAGeCK-RRA 用于通過負(fù)二項(xiàng)分布識(shí)別顯著富集的 sgRNA，scMAGeCK-LR 用于通過線性回歸評(píng)估受影響的基因。scMAGeCK 顯示出對(duì)假陽性的良好控制，并且比其他方法具有更好的靈敏度。除了 scCRISPR-seq 的通用計(jì)算框架外，一些工具還專注于數(shù)據(jù)去噪。例如，SCEPTRE 是為使用條件隨機(jī)化測(cè)試進(jìn)行 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)校準(zhǔn)而開發(fā)的。SCEPTRE 對(duì) scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)表現(xiàn)出良好的校準(zhǔn)和靈敏度，產(chǎn)生了數(shù)百種由正交生物學(xué)證據(jù)支持的新調(diào)控關(guān)系。Mixscape 旨在通過混合判別分析過濾逃逸的細(xì)胞 （細(xì)胞誘導(dǎo)的 sgRNA，但不表現(xiàn)出擾動(dòng)效應(yīng)） 來提高 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)的信噪比。Normalisr 用于重建 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Wang 等人.（2022g） 強(qiáng)調(diào)了識(shí)別克隆細(xì)胞的重要性，因?yàn)樗鼈兛赡軐?dǎo)致 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)出現(xiàn)假陽性。SCREE 是 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)分析的綜合管道。與前面提到的最初專注于 scCRISPR-seq 中的數(shù)據(jù)去噪和挖掘的方法相比，GEARS 專門設(shè)計(jì)用于預(yù)測(cè)對(duì)單基因和多基因擾動(dòng)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這些方法大大增強(qiáng)了 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)的分析。
scCRISPR-seq 的應(yīng)用
scCRISPR-seq 因其強(qiáng)大的能力而被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，包括連接基因型與表型、剖析遺傳調(diào)控以及研究腫瘤和自閉癥等非特異性疾病的遺傳機(jī)制。
連接基因型和表型
與傳統(tǒng)的 CRISPR 篩選只能識(shí)別具有非常不同表型的基因相比，scCRISPR-seq 具有揭示任何基因功能的能力。因此，scCRISPR-seq 天然適合大規(guī)模地將基因型與表型聯(lián)系起來。例如，Jaitin 等。（2016） 揭示了 22 個(gè) TFs 對(duì) CRISP-seq 刺激的脂多糖 （LPS） 刺激的出生骨髓細(xì)胞 （BMC） 的抗病毒、炎癥或發(fā)育過程的調(diào)節(jié)作用。Adamson 等人。（2016） 通過 Perturb-seq 系統(tǒng)分析了 K562 細(xì)胞中 83 個(gè)未折疊蛋白反應(yīng) （UPR） 相關(guān)基因的影響。此外，基因組規(guī)模的 Perturb-seq（Replogle等人，2022 年）提供了對(duì)遺傳擾動(dòng)（9,867 個(gè)基因）的公正、全面的分析，有助于系統(tǒng)剖析與基因翻譯和核糖體生物發(fā)生相關(guān)的基因之間的關(guān)系。
剖析遺傳調(diào)控
scCRISPR-seq 還用于剖析基因組元件之間的復(fù)雜關(guān)系，包括編碼基因、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子、增強(qiáng)子和其他非編碼元件。例如，Adamson 等人。（2016） 使用 Perturb-seq 發(fā)現(xiàn)了三個(gè) UPR 傳感器基因（ATF6、PERK 和 IRE1）之間的串?dāng)_。CROP-seq 擾亂了 LPS 刺激后 Jurkat 細(xì)胞中調(diào)節(jié) TCR 激活的 TFs，并揭示了 TFs 之間的關(guān)系。此外，用于增強(qiáng)子擾動(dòng)的 scCRISPR-seq，例如 Mosaic-seq （Xie et tal.， 2017），可以發(fā)現(xiàn)新的增強(qiáng)子-基因?qū)Α４送猓瑂cCRISPR-seq 與 scATAC-seq 偶聯(lián)，如 Perturb-ATAC、Spear-ATAC 和 CRISPR-sciATAC 可以揭示人淋巴細(xì)胞和白血病細(xì)胞中的表觀遺傳景觀重塑劑
研究遺傳機(jī)制
有幾種體內(nèi) scCRISPR-seq 平臺(tái)可用，能夠研究腫瘤和自閉癥等非特異性疾病的遺傳機(jī)制。例如，Perturb-map （Dhainaut et.， 2022） 有助于識(shí)別與腫瘤組成、組織和免疫相關(guān)的遺傳決定因素。Using Perturbmap， Dhainaut etal.（2022） 發(fā)現(xiàn) TGFBR2 肺癌細(xì)胞的敲除促進(jìn)了腫瘤微環(huán)境重塑和免疫排斥。Roth 等人。（2020） 使用 PoKI-seq 對(duì)增強(qiáng) T 細(xì)胞抗腫瘤功能的嵌合抗原受體進(jìn)行了篩選，提高了免疫抑制條件下的腫瘤浸潤(rùn)和細(xì)胞殺傷率 內(nèi)黑色素瘤。此外，Jin 等人。（2020b） 使用 invivo Perturb-seq 評(píng)估了 35 個(gè)與自閉癥譜系障礙/神經(jīng)發(fā)育遲緩 （ASD/ND） 相關(guān)的 denovo 功能喪失風(fēng)險(xiǎn)基因。他們從神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類別中鑒定了細(xì)胞類型特異性和進(jìn)化上保守的基因模塊。利塔爾。（2023） 還關(guān)注了這些高危自閉癥譜系障礙基因，他們揭示了它們對(duì)使用 CHOOSE 系統(tǒng)在嵌花類器官中決定細(xì)胞命運(yùn)的影響。最近，Santinha 等人。（2023） 使用 AAV-Perturb-seq 系統(tǒng)分析了與成年小鼠大腦前額葉皮層中 22q11.2 缺失綜合征基因相關(guān)的表型景觀。他們確定了三個(gè) 22q11.2 連鎖基因，這些基因積極參與已建立的和以前未識(shí)別的體內(nèi)神經(jīng)元功能控制途徑。
總結(jié)
在本章中，我們對(duì) scCRISPR-seq 進(jìn)行了全面的回顧，分為三個(gè)不同的部分，其中包括 scCRISPR-seq 的類別、scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)分析的工具以及 scCRISPR-seq 的顯著應(yīng)用。scCRISPR-seq 一直是功能基因組學(xué)研究的強(qiáng)大方法 （Bock et al.， 2022）。在本節(jié)中，我們根據(jù)其綜合組學(xué)方法將 scCRISPR-seq 分為三個(gè)主要類別：基于轉(zhuǎn)錄組的 scCRISPRseq、基于表觀基因組的 scCRISPR-seq 和多模態(tài) scCRISPRseq。鑒于 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)中固有的噪聲，已經(jīng)開發(fā)了多種生物信息學(xué)工具來幫助初始化分析，從而沒有顯著改進(jìn)。
scCRISPR-seq 的多功能性使其在各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，提供了強(qiáng)大的功能，例如連接基因型與表型、剖析遺傳調(diào)控以及探索腫瘤和自閉癥等特定疾病的遺傳機(jī)制。然而，在生物學(xué)研究中更廣泛地采用之前，需要注意三個(gè)關(guān)鍵方面：（i） 降低復(fù)雜性和成本：應(yīng)努力進(jìn)一步簡(jiǎn)化和降低 scCRISPR-seq 實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和成本。這將增強(qiáng)可擴(kuò)展性和可及性，使更多實(shí)驗(yàn)室能夠利用這項(xiàng)技術(shù)。（ii） 擴(kuò)大對(duì)復(fù)雜組織和體內(nèi)設(shè)置的適用性：雖然目前的 scCRISPR-seq 平臺(tái)主要針對(duì)細(xì)胞系，但迫切需要開發(fā)更強(qiáng)大的 scCRISPR-seq 平臺(tái)，這些平臺(tái)可以應(yīng)用于更復(fù)雜的組織，包括類器官，以及理想的體內(nèi)設(shè)置。這種擴(kuò)展將使更廣泛的生物學(xué)研究成為可能。（iii） 降噪技術(shù)：隨著 scCRISPR-seq 平臺(tái)數(shù)量的增加，開發(fā)更強(qiáng)大的方法來破譯 scCRISPR-seq 數(shù)據(jù)中的固有噪聲變得至關(guān)重要。這些方法將有助于 scCRISPR-seq 結(jié)果的可靠性和可解釋性，進(jìn)一步提高它們?cè)诓煌芯凯h(huán)境中的實(shí)用性。
結(jié)尾
scRNA-seq 技術(shù)引起了世界各地許多科學(xué)家的廣泛關(guān)注，因?yàn)樗哂性趩渭?xì)胞水平上研究細(xì)胞異質(zhì)性的優(yōu)勢(shì)。自新時(shí)代 inscRNA-seq 研究成立以來，已經(jīng)過去了僅僅 14 年，在此之前，Tang 等人取得了初步的概念和技術(shù)突破。（2009） 在 2009 年。在測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)不斷發(fā)展的推動(dòng)下，scRNA-seq 研究領(lǐng)域目前正在經(jīng)歷研究的激增。scRNA-seq 技術(shù)的成熟極大地促進(jìn)了其他單細(xì)胞組學(xué)研究的進(jìn)步。目前，單細(xì)胞組學(xué)檢測(cè)已擴(kuò)展到基因組 （Dey et al.， 2015）、表觀基因組 （Muto et al.， 2021）、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué) （Chen et al.， 2022）、蛋白質(zhì)組學(xué) （Petersonet al.， 2017;Specht et al.， 2021）、代謝組學(xué) （Shrestha， 2020） 等多組學(xué)水平 （Angermueller et al.， 2016），為單細(xì)胞水平研究提供更全面、更精細(xì)、更完整的分析策略。在這篇綜述中，我們總結(jié)了單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)、數(shù)據(jù)分析及其應(yīng)用的最新進(jìn)展，概述了單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域跨多個(gè)層次的前景。
在第 1 章中，我們?nèi)娓攀隽四壳翱捎玫?scRNA-seq 技術(shù)、實(shí)驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)分析程序及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。最初，通過分離單細(xì)胞并獨(dú)立構(gòu)建測(cè)序文庫來進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。這些單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)只能檢測(cè)少量細(xì)胞（數(shù)到數(shù)百個(gè)），例如 Tang 方法、STRT-seq 和 SMART-seq（Islam 等人，2012 年;Ramsköld 等人，2012 年;Tang 等人，2009 年）。然而，隨著對(duì)測(cè)序技術(shù)的深入研究，基于條形碼標(biāo)簽的單細(xì)胞鑒定已經(jīng)出現(xiàn)，以及基于微滴或微孔的新型單細(xì)胞分離技術(shù)的出現(xiàn)，如 Drop-Seq 和 Cyto-Seq （Fan et.， 2015a;Macosko 等人，2015 年），單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已進(jìn)入高通量時(shí)代。測(cè)序成本顯著降低，同時(shí)自動(dòng)化和通量顯著提高。ScRNAseq 技術(shù)解決了細(xì)胞異質(zhì)性問題，為臨床疾病尤其是腫瘤的個(gè)體化治療開辟了新途徑，促進(jìn)了精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。然而，由于起始材料量少，scRNA-seq 存在 oflow 捕獲效率和高脫落率的局限性。與大量 RNA-seq 相比，scRNA-seq 產(chǎn)生的數(shù)據(jù)噪聲更大且可變性更強(qiáng)。盡管研究人員已經(jīng)設(shè)計(jì)了多種工具來進(jìn)行不同的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)分析，但技術(shù)噪聲和生物變異（例如，隨機(jī)轉(zhuǎn)錄）仍然對(duì) scRNA-seq 數(shù)據(jù)的計(jì)算分析構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)（Chen 等人，2019a）。因此，數(shù)據(jù)分析方法仍需進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)。
與日益成熟的 scRNA-seq 技術(shù)相比，其他單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)仍處于萌芽階段。在第 2、3、4 和 5 章中，我們重點(diǎn)介紹了過去十年中單細(xì)胞基因組、表觀基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)測(cè)序的最新工具、計(jì)算方法和應(yīng)用。ScWGS 徹底改變了我們對(duì)遺傳變異及其對(duì)人類健康和疾病影響的理解。它的快速發(fā)展加速了基因組研究，實(shí)現(xiàn)了個(gè)性化醫(yī)療，并為疾病的遺傳基礎(chǔ)和人類基因組多樣性提供了有價(jià)值的見解。細(xì)胞在染色質(zhì)可及性、核小體定位、組蛋白修飾和 DNA 甲基化方面表現(xiàn)出廣泛的異質(zhì)性。在單細(xì)胞樣品中繪制這些表觀基因組信息對(duì)于發(fā)育生物學(xué)、癌癥研究以及很快的發(fā)展非常重要。單細(xì)胞表觀基因組測(cè)序方法的進(jìn)步使單細(xì)胞染色質(zhì)狀態(tài)的高分辨率圖譜成為可能。然而，如今，單細(xì)胞表觀基因組技術(shù)存在數(shù)據(jù)丟失的問題。因此，盡管單個(gè)細(xì)胞表觀基因組數(shù)據(jù)集是聚類分析和基于大量目標(biāo)位點(diǎn)集合揭示細(xì)胞異質(zhì)性的強(qiáng)大資源，但它們提供單個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)信息的能力非常有限（Carter 和 Zhao，2021）。因此，在未來的研究中，需要提高各種單個(gè)細(xì)胞表觀基因組測(cè)定中染色質(zhì)靶位點(diǎn)的覆蓋率，這將有助于理解整個(gè)細(xì)胞水平和單個(gè)特異性位點(diǎn)的細(xì)胞異質(zhì)性。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)由于其成分復(fù)雜、豐度低、動(dòng)態(tài)范圍寬、缺乏擴(kuò)增能力，處于爆發(fā)性發(fā)展的早期階段。就在 2019 年，對(duì)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的分析被描述為“夢(mèng)想”，但今天已經(jīng)開發(fā)了幾種有前途的工具（Marx，2019）。我們相信，隨著可及性的優(yōu)化和通量的進(jìn)一步提高，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)在科學(xué)和臨床研究中真正的大規(guī)模應(yīng)用，如器官圖譜、藥物篩選和精確的疾病分類，是觸手可及的。單細(xì)胞代謝組學(xué)用于鑒定單細(xì)胞中代謝物的組成，測(cè)量其豐度，并研究其動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)，代謝組代表基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的下游產(chǎn)物，并提供了功能的更直接和動(dòng)態(tài)快照（Shrestha，2020 年）。總體而言，單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)仍處于萌芽階段，它們將繼續(xù)蓬勃發(fā)展。
單個(gè)細(xì)胞是生命的基本單位。對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多組學(xué)分析可以深入了解細(xì)胞的表型、疾病狀態(tài)和環(huán)境影響。在第 6 章、第 7 章和第 8 章中，我們?nèi)婵偨Y(jié)了多組學(xué)的綜合分析、scRNA-seq 和 CRISPR 篩選的聯(lián)合應(yīng)用以及空間轉(zhuǎn)錄組。在復(fù)雜的生物過程中，例如腫瘤發(fā)生和衰老，異質(zhì)性發(fā)生在不同的層面，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和表觀基因組。如果僅從單個(gè)細(xì)胞 atatime 分析一個(gè)成分，則只能檢測(cè)到基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的局部概況，而無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)復(fù)雜的全球情況。在這種情況下，多組學(xué)技術(shù)凸顯其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以在復(fù)雜組織的研究中提供更完整的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖譜。對(duì)于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，它能夠在保留空間信息的情況下測(cè)量基因表達(dá)，這將有利于研究細(xì)胞間關(guān)系和發(fā)現(xiàn)空間背景下的新調(diào)控機(jī)制。此外，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)使探索細(xì)胞命運(yùn)決定的空間調(diào)控機(jī)制和組織模式的結(jié)構(gòu)成為可能。與傳統(tǒng)的 CRISPR 雜交篩選相比，scRNA-seq 和 CRISPR 的組合不僅可以在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中篩選數(shù)千個(gè) gRNA，還可以同時(shí)捕獲擾動(dòng)的全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以最清楚地了解細(xì)胞類型特異性基因功能和通路分析。因此，這些技術(shù)的結(jié)合可以更好、更深入地理解關(guān)鍵的生物過程和機(jī)制，這是未來單細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的重要方向。
如今，單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)在通量和分辨率方面都取得了重大進(jìn)步。展望未來，單細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的主要趨勢(shì)是提高單細(xì)胞分選的效率和通量，增強(qiáng)測(cè)序覆蓋率和靈敏度，實(shí)現(xiàn)高通量多組學(xué)研究，并開發(fā)更多自動(dòng)化的單細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)，這將有助于降低單細(xì)胞技術(shù)的成本和技術(shù)門檻。單細(xì)胞技術(shù)有望在科學(xué)研究和研究轉(zhuǎn)化領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并將對(duì)健康監(jiān)測(cè)、疾病診斷和治療做出巨大貢獻(xiàn)。
參考文獻(xiàn)：
Sun F, Li H, Sun D, et al. Single-cell omics: experimental workflow, data analyses and applications. Sci China Life Sci. 2025;68(1):5-102. doi:10.1007/s11427-023-2561-0