期刊：Cell Reports Medicine
影響因子：10.6
通訊作者：四川大學華西醫院血液內科牛挺/趙艾琳/吳奕君團隊
伯豪產品服務：伯優®FFPE樣本細胞核分離試劑盒（#52301-10）
導語
黏膜相關淋巴組織（MALT）淋巴瘤是最常見的結外邊緣區B細胞淋巴瘤，其發生發展高度依賴于腫瘤微環境（LME）中的免疫與基質細胞網絡。然而，由于腫瘤發生部位多樣（胃、眼附屬器、甲狀腺、肺等）、遺傳背景復雜（BIRC3/MALT1融合、TNFAIP3突變等），MALT淋巴瘤的微環境異質性及其臨床意義長期未被系統解析。傳統的Bulk轉錄組分析雖能揭示整體表達譜變化，卻無法區分惡性細胞與微環境細胞的各自貢獻；單細胞技術雖能解析細胞異質性，但在FFPE樣本中應用困難；空間轉錄組則能提供組織原位信息，但通量與分辨率有限。如何整合這些技術，構建一個跨組織、多層次的MALT淋巴瘤微環境圖譜，是該領域亟待解決的核心問題。
2026年4月，《Cell Reports Medicine》 發表了一項題為“Cross-tissue atlas of mucosa-associated lymphoid tissue lymphomas reveals intratumoral heterogeneity and microenvironmental subtypes”的研究。該研究整合了Bulk RNA-seq、單細胞核RNA-seq（snRNA-seq）和空間轉錄組技術，對來自胃、眼附屬器等多個部位的89例MALT淋巴瘤樣本進行了系統性分析，首次構建了MALT淋巴瘤的LME三維圖譜，并識別出三種具有不同細胞組成、信號通路活性及治療敏感性的微環境亞型。本文將從RNA-seq技術整合視角，詳細解讀該研究如何通過多層次的轉錄組分析，逐步揭示MALT淋巴瘤的微環境異質性及其臨床轉化價值。
產品服務
伯優®FFPE樣本細胞核分離試劑盒（#52301-10）
主要研究
一、Bulk RNA-seq奠定分型基礎：三種LME亞型的首次識別
1.1 大規模多中心隊列的整合與批次校正
研究首先回顧性收集了四川大學華西醫院2020年1月至2023年6月期間經病理確診的89例MALT淋巴瘤FFPE樣本（WCH隊列），其中胃部38例、眼附屬器30例，其余來自肺、腮腺、甲狀腺等部位。考慮到回顧性隊列缺乏正常對照，研究者進一步納入兩個公共Bulk RNA-seq隊列（GSE171059、GSE218618），分別包含21例和10例眼附屬器MALT淋巴瘤及其匹配的正常組織。最終整合數據集包含145個樣本，其中120例腫瘤、25例正常對照（圖1B）。腫瘤樣本中，眼附屬器占50.8%（61例），胃部占31.7%（38例）。臨床信息完整的110例患者中，55.5%為男性，52.7%年齡≥60歲，62.7%為Ann Arbor I期（圖1C）。
為消除不同測序平臺和實驗批次帶來的技術差異，研究采用ComBat算法進行批次效應校正。校正后的主成分分析（PCA）顯示，不同隊列和不同解剖部位的樣本均勻混合（圖S1A），為后續聯合分析奠定了可靠基礎。與正常組織相比，MALT淋巴瘤樣本顯著上調B細胞相關基因（MS4A1、CD79A、PAX5），并富集E2F靶點、G2/M檢查點等增殖通路以及未折疊蛋白反應、DNA修復等腫瘤相關通路（圖S1B、S1C）。這些結果表明，整合后的Bulk數據能夠有效捕捉MALT淋巴瘤的惡性轉化特征。
1.2 基于單細胞特征的微環境分型
傳統的Bulk分型往往直接對所有基因進行聚類，但這樣容易受到惡性B細胞高表達基因的干擾，掩蓋微環境的真實異質性。本研究采取了一種創新的策略：先通過snRNA-seq定義微環境細胞亞群的特征基因，再將這些特征投射回Bulk數據中進行分型。具體而言，研究者從snRNA-seq獲得的非B細胞亞群（T細胞、髓系細胞、基質細胞等）中提取了差異表達基因作為微環境特征集，排除了B細胞相關基因，從而避免腫瘤細胞豐度對微環境信號的稀釋。
隨后，研究使用GSVA（Gene Set Variation Analysis）對120個腫瘤樣本進行特征評分，評分結果經min-max歸一化后，采用非負矩陣分解（NMF）進行無監督聚類。NMF的秩（rank）通過殘差平方和的拐點確定為3（圖S4B）。聚類結果穩定識別出三種LME亞型（圖1G）：
- LME1（間質型）：高表達TGF-β、細胞外基質（ECM）和血管生成通路，富集內皮細胞、周細胞、中性粒細胞和Mac_MARCO巨噬細胞（圖1H、圖S5D）。
- LME2（炎癥型）：高表達干擾素信號和免疫激活通路（TNF-α、IFN-γ），富集T細胞、樹突狀細胞和Mac_SPARC巨噬細胞（圖1H、圖S5D）。
- LME3（耗竭型）：微環境特征全局低表達，細胞組成稀疏，類似“冷腫瘤”狀態。
重要的是，這種基于微環境特征的分型與使用已報道的泛淋巴瘤微環境基因集（Kotlov et al., Cancer Discovery 2021）得到的結果高度一致（圖S4C），驗證了分型的穩健性。
1.3 臨床關聯與預后意義
LME亞型與臨床特征存在顯著關聯：胃部MALT淋巴瘤和BIRC3/MALT1融合在LME1中更為常見（圖1I）。生存分析顯示，LME2、晚期（III/IV期）和BIRC3/MALT1融合均與顯著更差的無進展生存期（PFS）相關（圖1J、圖S5A）。多因素Cox回歸進一步證實，這三個因素是獨立的預后因子（圖S5B、S5C）。其中LME2預后最差，可能與其高度的免疫激活導致的免疫耗竭及惡性B細胞持續增殖信號有關。
綜上，Bulk RNA-seq通過整合大規模隊列和微環境特征導向的聚類策略，首次建立了MALT淋巴瘤的LME三分類體系，為后續單細胞和空間層面的機制解析提供了清晰的分組框架。
二、snRNA-seq解析細胞異質性：從B細胞惡性程序到免疫亞群功能差異
2.1 FFPE樣本的單細胞核測序技術突破
FFPE（福爾馬林固定石蠟包埋）樣本是臨床病理檔案的主要形式，但傳統單細胞測序對新鮮組織的要求限制了其在回顧性研究中的應用。本研究采用10x Genomics Flex平臺，該平臺通過探針雜交技術，能夠對FFPE樣本的細胞核進行轉錄組捕獲。研究者從16例手術切除標本中制備了50μm厚的FFPE卷片，經核分離、DV200質控（>50%）、細胞核完整性評估（>80%）后，成功獲得高質量snRNA-seq數據。經過CellBender去除背景噪音和嚴格質控（每個細胞核100–2500個基因、線粒體轉錄本<10%），最終保留96,778個細胞核。
數據經Harmony批次校正、PCA降維和Louvain聚類后，基于經典標記基因注釋出六大主要細胞系：B細胞、T細胞、髓系細胞、基質細胞、肝細胞和肺泡細胞（圖1E、圖S2A）。進一步的亞聚類（subclustering）識別出更精細的細胞亞群，如CD8+ T細胞分為Teff、Temra和Tex，CD4+ T細胞分為Treg、Tfh和Tn，巨噬細胞分為SPARC、STAB1、MARCO和CHIT1等（圖S2B–S2D）。
圖1. MALT淋巴癌的LME亞型鑒定
2.2 惡性B細胞與正常B細胞的區分策略
由于MALT淋巴瘤中B細胞以惡性克隆為主，但FFPE樣本中可能混雜正常組織來源的B細胞，準確區分兩者至關重要。研究者采用了兩條互補策略：一是使用inferCNV基于表達強度推斷拷貝數變異（CNV），惡性B細胞通常表現出較大范圍的染色體拷貝數改變；二是使用GSVA計算邊緣區B細胞（MZB）特征評分（Mabbott & Gray, Immunology 2014），因為MALT淋巴瘤起源于MZB。結果顯示，B_Mal（惡性B細胞）的CNV評分和MZB評分均顯著高于B_Nor（正常B細胞）（圖S3A–S3C）。此外，研究者還計算了每個細胞亞群的Shannon熵，以評估其在不同組織來源樣本中的分布均勻性。5個低熵（<0.5）且>80%富集于肺或肝臟的亞群被判定為正常組織污染，從下游分析中剔除（圖S4A）。這些質控步驟確保了后續分析聚焦于真正的腫瘤微環境。
2.3 惡性B細胞的轉錄元程序（MP）
為了解惡性B細胞內部的功能異質性，研究者對61,844個B_Mal細胞應用了NMF分解，每個樣本獨立運行秩4到9的NMF，共獲得39個程序。通過比較不同秩之間以及不同樣本之間程序基因的重疊度（≥70%程序內重疊，≥20%跨樣本重疊），篩選出穩健的程序，再基于共享基因比例聚類，最終定義了7個元程序（MP），每個MP包含50個代表性基因（圖2A、表S3）。功能注釋顯示：
- MP1（G1/S期） 和 MP3（G2/M期）：細胞周期相關，在LME3中富集（圖2H）。單因素Cox回歸顯示兩者均為不良預后因子（圖2F）。
- MP2（未折疊蛋白反應）：與漿細胞分化相關。
- MP4（B細胞激活）：在LME2中最高（圖2H），與BTK信號通路活性一致。
- MP5（核酸結合）：可能在轉錄調控中發揮作用。
- MP6（免疫球蛋白產生）：與漿細胞分化一致，且與MP3呈負相關，CytoTRACE2分析也顯示MP6高表達的細胞分化程度更高（圖2C、2D）。
- MP7（免疫調節）：包含CCL22和CCL17，已知可招募調節性T細胞（Treg）。MP7評分與CD4T_Treg細胞在CD4+ T細胞中的比例呈顯著正相關（Pearson r = 0.78，圖2G），提示惡性B細胞通過分泌趨化因子塑造免疫抑制微環境。
將B_Mal特征基因集應用于Bulk RNA-seq樣本進行評分，并按中位數分組，高B_Mal評分組PFS顯著更差（圖2E）。值得注意的是，MP評分在不同LME亞型間差異顯著，但在不同臨床分期或年齡組間差異不顯著（圖S6B），說明LME分型比傳統臨床指標更能反映惡性B細胞的功能狀態。
2.4 亞型特異性藥物敏感預測
利用單細胞分辨率的數據，研究采用Beyondcell（基于藥物反應基因特征）和scRANK（基于靶點擾動基因調控網絡）兩種獨立算法預測藥物敏感性。結果高度一致（圖2I、圖S7B）：
- LME1：對VEGFR抑制劑（索拉非尼、阿昔替尼、舒尼替尼）敏感，與其富含內皮細胞和血管生成通路一致。
- LME2：對BTK抑制劑（伊布替尼）敏感，與其高MP4（B細胞激活）一致。
- LME3：對微管靶向藥物（長春新堿、長春瑞濱）敏感，與其高MP3（G2/M）一致。
免疫組化驗證顯示，LME1樣本VEGFR2表達最高，LME2樣本BTK表達最高，LME3樣本Ki-67增殖指數最高（圖S7C）。這些結果直接支持了LME分型指導精準治療的潛力。
圖2. 惡性B細胞的功能異質性與藥物敏感性
2.5 T細胞、髓系細胞和基質細胞的精細圖譜
snRNA-seq的優勢在于能夠解析稀有的免疫和基質亞群。研究對T細胞、髓系細胞、成纖維細胞和內皮細胞分別進行了深度亞聚類：
- CD8+ T細胞：LME2中耗竭表型（CD8T_Tex，表達HAVCR2、LAG3、PDCD1）比例顯著高于LME1；而LME1中效應記憶T細胞（CD8T_Temra，表達GNLY、GZMB、PRF1）更富集（圖3A、3D）。功能評分顯示，LME2的CD8T_Tex具有最高的耗竭評分和最低的細胞毒性評分（圖3C、3D）。
- 巨噬細胞：根據FOLR2和MRC1（CD206）的表達分為四個亞群。其中Mac_MARCO（FOLR2?MRC1?）在LME1中顯著富集，具有最高的M2評分、血管生成評分和吞噬評分，是LME1中血管生成的關鍵驅動細胞（圖3E–3I）。Mac_SPARC（FOLR2?MRC1?）在LME2中富集，偏向M1和Th1分化。
- 成纖維細胞：Fibro_CCL19（炎癥相關）在LME2中富集，高表達抗原加工提呈和TNF-α/NF-κB通路；Fibro_LRRC15（肌成纖維細胞）在LME1中富集，高表達ECM相關基因（圖3J–3O）。NicheNet分析進一步預測，TNF-α/NF-κB2信號驅動Fibro_CCL19，TGFB1/TGFB2驅動Fibro_LRRC15（圖3L、3M）。
- 內皮細胞：分為靜脈內皮（Endo_venous）、動脈內皮（Endo_arterial）和淋巴內皮（Endo_lymphatic）。LME1中動脈內皮血管生成評分更高，LME2中淋巴內皮淋巴細胞趨化評分更高（圖S9E、S9G）。
這些結果表明，snRNA-seq不僅揭示了細胞組成的差異，更捕獲了同一細胞亞群在不同LME中功能狀態的轉變。
圖3. LME亞型中的免疫細胞和間質細胞異質性
三、細胞互作網絡的定量分析：CellChat揭示亞型特異性信號流
細胞間的配體-受體相互作用強度也是微環境功能的核心。研究使用CellChat對snRNA-seq數據進行分析，分別計算了每種LME亞型中的通信概率。
- 總體通信強度：LME1和LME2顯著高于LME3，后者因細胞稀疏而信號減弱（圖4C）。
- 通路偏好：LME1中血管生成相關通路（VEGF、TGF-β、PDGF、膠原）占主導；LME2中淋巴細胞和B細胞激活相關通路（ICAM、CXCL、CD40、BAFF）占主導（圖4D）。
- 關鍵細胞發送者/接收者：在LME2中，Mac_SPARC、FDC_CR2和Fibro_CCL19是信號的主要發送者，向T細胞和B細胞傳遞CD40、BAFF和CXCL信號（圖4E–4G）。在LME1中，Neu_GOS2和Mac_MARCO是VEGF信號的主要發送者，作用于血管內皮（圖4H–4I）。
特別值得注意的是，BAFF信號在LME2中主要由惡性B細胞自分泌，而CD40信號則主要來自其他細胞的旁分泌（圖S10B–S10D）。這一發現提示，在炎癥型微環境中，惡性B細胞不僅接受外源性支持，還通過自分泌BAFF實現一定程度的自主生長，與既往報道的HP感染非依賴性MALT淋巴瘤生長機制一致。
圖4. 細胞模塊及胞間通訊網絡
四、空間轉錄組驗證細胞互作網絡：從共定位到信號距離
4.1 空間轉錄組實驗設計與細胞類型映射
單細胞數據雖然提供了高分辨率的細胞異質性信息，但丟失了細胞在組織中的原始空間位置。為了在原位驗證細胞互作關系，研究者選取了9例FFPE樣本（每種LME亞型3例，包括胃和眼附屬器等部位），進行10x Visium空間轉錄組測序。FFPE切片經H&E染色、探針雜交和CytAssist處理，測序后使用spaceranger進行定量。
為了將snRNA-seq定義的細胞亞群映射到空間轉錄組的每個spot（每個spot約含1–10個細胞），研究采用了cell2location貝葉斯模型。該模型利用snRNA-seq作為參考，估算每個spot中每種細胞類型的絕對豐度。7例空間樣本有匹配的snRNA-seq數據（來自同一組織塊），確保了映射的可靠性。
4.2 空間因子與細胞模塊的共定位
基于cell2location的豐度估計，研究使用run_colocation函數提取了5個空間因子（SFs），每個SF代表一組經常共定位的細胞亞群（圖5B）。結果顯示：
- SF2和SF3：主要包含CM1模塊的細胞（CD8T_Tex、CD4T_Treg、CD4T_Tfh、DC、Mac_SPARC、Fibro_CCL19、Endo_lymphatic、FDC_CR2），在LME2中貢獻度更高（圖5D）。
- SF5：主要包含CM2模塊的細胞（血管內皮、Neu_GOS2、Mac_MARCO、周細胞），在LME1中貢獻度更高（圖5D）。
- SF4：富集于壞死或基質區域（圖5C）。
這些空間因子與之前基于細胞比例相關性分析得到的細胞模塊（CM1、CM2，圖4A）高度一致，從空間上驗證了這些細胞群的內聚性。
4.3 距離分析與配體動態
研究進一步計算了每個B_Mal陽性spot到其他細胞類型陽性spot的最短歐氏距離（若兩個類型在同一spot內則距離為0）。結果顯示，在LME2中，B_Mal與CD8T_Tex、CD4T_Tfh、FDC_CR2、Mac_SPARC的距離顯著更近（圖5G），支持LME2中免疫細胞與惡性B細胞的緊密空間接觸。
更為重要的是，研究者分析了配體表達水平與細胞間距離的相關性。例如，對于每個spot，計算其到最近的CD4T_Tfh陽性spot的距離，然后與該spot的CD40LG表達做Spearman相關。在LME2中，CD40LG表達與距離呈顯著負相關（即越靠近Tfh，CD40LG表達越高），而在LME1中無此趨勢（圖5H）。同樣，在LME1中，VEGFA表達與到Neu_GOS2或Mac_MARCO的距離呈負相關（圖5H）。這些定量分析首次在MALT淋巴瘤中證明了關鍵配體的表達具有空間梯度依賴性，為旁分泌信號網絡提供了直接的空間證據。
4.4 多色免疫熒光（mIF）驗證
為了在蛋白水平驗證空間關系，研究者對15個樣本（每種亞型5例）進行了多色免疫熒光染色（圖5I）。結果顯示：
- 在LME2中，PAX5?惡性B細胞與FOXP3?CD4?T細胞、PD1?CD8?T細胞的空間距離顯著小于LME1（圖5J）。
- 在LME1中，CD31?血管內皮細胞密度最高，且CD11b?CD15?中性粒細胞和CD206?MARCO?巨噬細胞更靠近內皮細胞（圖5L）。VEGFA?的中性粒細胞和巨噬細胞比例在LME1中更高，且它們比VEGFA?的同類細胞更靠近內皮細胞（圖S13E、S13F）。
這些獨立驗證結果與空間轉錄組的發現高度一致，增強了結論的可信度。
圖5. 胞間互作的空間分布
結語
該研究通過Bulk RNA-seq、snRNA-seq和空間轉錄組的系統整合，首次繪制了跨組織MALT淋巴瘤的微環境異質性圖譜，識別出三種具有不同細胞組成、信號網絡和治療敏感性的LME亞型。研究不僅揭示了惡性B細胞內在的轉錄程序異質性（7個MP），還解析了免疫與基質細胞在LME亞型間的功能可塑性，并通過空間轉錄組和mIF驗證了關鍵配體-受體互作的空間梯度。這一工作為MALT淋巴瘤的精準分型和靶向治療提供了堅實的分子基礎，同時也為FFPE樣本的回顧性多組學研究樹立了一個高質量的技術示范。
Fig 8.Rac1介導COH實驗性青光眼中RGC軸突退變的信號通路機制模式圖
參考文獻：
Kang K, Wu Y, Sun X, et al. Cross-tissue atlas of mucosa-associated lymphoid tissue lymphomas reveals intratumoral heterogeneity and microenvironmental subtypes. Cell Rep Med. 2026;7(5):102785. doi:10.1016/j.xcrm.2026.102785
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