文章標題：Integrated Proteomics and Metabolomics Analysis of Nitrogen System Regulation on Soybean Plant Nodulation and Nitrogen Fixation

發表期刊：INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES

發表時間：2022.2

影響因子：5.923

合作客戶：東北農業大學農學院

百趣生物提供服務：蛋白質組學分析和代謝組學分析

1、研究背景

大豆產量取決于根瘤固氮和氮施肥的綜合作用，而大豆根系暴露于高濃度氮條件下，可抑制根瘤生長，加速根瘤衰老，降低固氮的效率。氮影響豆科作物結瘤和固氮的具體機制尚不清楚。為研究大豆中氮、結瘤與固氮的關系，采用嫁接法制備了單側結瘤的雙根大豆植株。在第3個三葉(V3)至第4個三葉(V4)生長期(5天)，向非結瘤側添加氮營養液，在結瘤側添加無氮營養液。百趣解讀，本實驗旨在研究外源氮對大豆根瘤中蛋白質和代謝物的影響，為分析大豆根瘤中施氮與固氮相互作用的生理機制。

2、研究結果

在V3期前，在大豆幼苗兩側加入氮素濃度為25mg/L(**銨濃度為71.4mg/L)的營養液進行培養。從V3期到V4期(為期5天)，將幼苗分為有氮處理或無氮處理的兩組。氮處理組在未結瘤根中加入氮濃度為100mg/L(**銨濃度為285.6mg/L)的營養液，在結瘤根中加入無氮營養液，記錄為NH。在無氮組的兩側加入無氮營養液，記錄為NF

氮供應對結節生長和固氮酶活性的影響

百趣解讀，通過對不同處理NH和NF向未結瘤的側根供氮5天后，了解在結瘤的側根上的根瘤數量和重量，5天供氮對根瘤的生長發育無顯著影響(表1)。圖1顯示了氮供應對雙根大豆根瘤中固氮酶活性的影響。向非結瘤側根供氮后，與NF處理相比，NH處理其結瘤側的特定固氮酶活性(SNA)和乙炔還原活性(ARA)分別降低了44.0%和41.0%，說明向非結瘤側根供氮5天對結瘤側根瘤的ARA和SNA有顯著影響。

表1. 雙根大豆根瘤數和干重的變化

圖1. 大豆雙根根瘤的固氮酶活性研究

大豆結節的蛋白質組學分析

通過分析了氮供應處理和對照之間的蛋白質組學變化，共鑒定出8573個蛋白，其中5279個蛋白屬于甘氨酸（大豆），3294個蛋白屬于日本慢生根瘤菌。按照治療組間的差異表達蛋白(DEPs)采用FC>1.2或FC<0.83，p值<0.05為標準，共鑒定出164個DEPs。

百趣解讀，利用GO數據庫進行注釋，研究了上述DEPs的功能。根據功能特征，DEPs屬于與細胞組分(CC)、分子功能(MF)和生物過程(BP)相關的三組。CC組大豆根瘤組織的DEPs多富集于淀粉質體、內質網、內膜系統、膜蛋白復合物等中。MF組中的DEPs主要富含糖原（淀粉）合酶活性、輔助因子結合、血紅素結合、四吡咯結合成分等。BP組主要富含淀粉生物合成過程、蛋白質退出內質網、淀粉代謝過程等（圖2）。這些結果表明，氮處理可以調節大豆根瘤組織的碳代謝和氮代謝，從而影響大豆根瘤的固氮能力。

百趣生物解讀，CC組大豆根瘤菌的DEPs多富集于細胞質、非膜結合細胞器、含蛋白復合物等中。MF組的DEPs主要富集于固氮酶活性、氧化還原酶活性等。BP組主要富集于固氮、氮循環代謝過程、有機氮化合物生物合成過程、細胞氮化合物代謝過程等（圖3）。結果表明大豆根瘤菌與根瘤組織的結果相同，根瘤菌中大部分差異蛋白在氮和碳代謝過程中富集。

圖2. 大豆結節組織中差異表達蛋白（DEPs）的GO注釋統計

圖3. 大豆根瘤菌中差異表達蛋白（DEPs）的GO注釋統計

利用(KEGG)通路分析，探索所鑒定的DEPs可能參與的代謝或信號通路。如圖4所示，大豆根瘤組織中的DEPs主要參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、葉酸、倍半萜和三萜生物合成、C5-支二酸代謝和內質網中的蛋白質加工。如圖5所示，大豆根瘤菌中的DEPs主要參與碳代謝、氮代謝、光合生物中的固碳作用、葉酸生物合成、果糖和甘露糖代謝、核糖體等方面。

圖4. 大豆根瘤組織中DEPs的KEGG通路

圖5. 大豆根瘤菌中DEPs的KEGG通路

大豆結節的代謝組學分析

百趣解讀，通過分析氮供應處理和對照之間的代謝組學方法測定大豆根瘤代謝譜的變化。治療組間的差異表達代謝物(DEMs)采用VIP>1，p值<0.05為標準，共鑒定出56種差異表達代謝物(DEMs)，其中上調20個，下調36個。利用代謝組學(KEGG)通路分析，探索富含差異代謝物的代謝組學代謝途徑。DEMs主要富集于代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、氨基酸生物合成、磷酸戊糖途徑、碳代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等方面。

圖6. 差異代謝物富含的KEGG通路分析

結合蛋白質組學和代謝組學分析治療組之間的DEPS和DEMs進行綜合KEGG途徑分析

百趣解讀，大豆根瘤組織中的KEGG途徑如圖7所示，這些途徑包括代謝組學代謝途徑、次級代謝產物的生物合成、內質網中的蛋白質加工、碳代謝、ABC轉運體、核糖體、氨基酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝等。大豆根瘤菌中的KEGG途徑如圖8所示，代謝途徑包括次級代謝產物的生物合成、異種抗生素的生物合成、葉酸生物合成等。

根瘤中的碳代謝是固氮的主要能量來源，蔗糖可通過淀粉合酶(StS)轉化為淀粉儲存，并通過蔗糖合酶(SS)催化轉化為UDP-葡萄糖和果糖為根瘤內固氮提供能量。氮的供應降低了精氨酸的濃度，而增加腐胺和ODC(A0A0A3Z5A3)的表達，研究表明腐胺、一氧化氮(NO)和天冬酰胺是調節根瘤固氮的信號分子(圖9)。在本研究中，通過比較治療間大豆，氮調控淀粉和蔗糖代謝、有機酸代謝、硫代謝、氮代謝、氨基酸代謝等代謝途徑。

圖7. 大豆結節組織中同時涉及DEPs和DEMs的KEGG通路

圖8. 大豆根瘤菌中同時涉及DEPs和DEMs的KEGG通路

圖9. DEPs和DEMs與結節中氮調控途徑

3、結論

通過比較氮處理和不氮處理大豆，氮調控淀粉和蔗糖代謝、有機酸代謝、硫代謝、氮代謝、氨基酸代謝等代謝途徑。此外，外源氮促進了根瘤中腐胺、一氧化氮和天冬酰胺的合成，抑制了蔗糖向蘋果酸的轉化；因此，根瘤菌缺乏固氮能量。此外，外源氮降低了根瘤細胞壁的合成，從而抑制了根瘤的生長和固氮。

文/阿趣代謝組學