蛋白質(zhì)修飾大揭秘—磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)
1、蛋白質(zhì)翻譯后修飾與磷酸化修飾的關(guān)系
蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Post-Translational Modifications, PTMs)是指在蛋白質(zhì)合成完成之后，通過添加化學(xué)基團(tuán)或蛋白質(zhì)間的化學(xué)交互作用來改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的過程。修飾作用可以改變蛋白質(zhì)的電荷、空間結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和親和性，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能、定位、相互作用和降解。PTMs增加了細(xì)胞蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性，為細(xì)胞提供了更多的功能和適應(yīng)性。
在組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，至少15種氨基酸已被報道能夠發(fā)生修飾作用。同時，在同一種氨基酸上可以發(fā)生多種修飾。目前超過680種修飾類型被發(fā)現(xiàn)并報道，包括磷酸化(Phosphorylation)、泛素化(Ubiquitination)、類泛素化(Ubiquitin-like modification）、甲基化(Methylation)、乙酰化(Acetylation)和糖基化(Glycosylation)等等。眾多的修飾類型進(jìn)一步增加了蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，這使多種生物學(xué)過程及信號通路受到影響。
圖1 蛋白質(zhì)翻譯后修飾的多樣性和復(fù)雜性[1]
圖2 蛋白質(zhì)磷酸化與其他修飾之間的Crosstalk[2]
2、蛋白質(zhì)磷酸化修飾主要特點(diǎn)
蛋白磷酸化是最常見的可逆PTMs，它是指在蛋白激酶的作用下，將ATP或GTP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過程，其可逆過程指的是在磷酸酯酶作用下，將發(fā)生磷酸化修飾的蛋白質(zhì)中的磷酸基團(tuán)脫除下來的過程。
據(jù)報道，有超過500種激酶和100種磷酸（酯）酶參與了蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化過程，這一可逆過程與細(xì)胞信號傳導(dǎo)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，生物體的真核細(xì)胞中約有1/3的蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化修飾作用，其中發(fā)生磷酸化修飾的位點(diǎn)主要集中在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上，其比例約為1800:200:1。
圖3 蛋白質(zhì)磷酸化修飾形成過程
圖4 蛋白質(zhì)磷酸化的重要功能[2]
3、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的定量分析方法
磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的定量方法主要有兩大類：非標(biāo)記定量法和標(biāo)記定量法。
（1）非標(biāo)記定量法
非標(biāo)記蛋白質(zhì)組定量技術(shù)是一種不依賴于同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)定量技術(shù)，該技術(shù)通過液質(zhì)聯(lián)用對蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行檢測，分析大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)時所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，常與數(shù)據(jù)非依賴采集(Data independent acquisition, DIA)或數(shù)據(jù)依賴采集模式(Data dependent acquisition, DDA)質(zhì)譜掃描模式相結(jié)合。
（2）標(biāo)記定量法
標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種多肽體外標(biāo)記定量技術(shù)。采用多種同位素的標(biāo)簽，可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈氨基）反應(yīng)實(shí)現(xiàn)連接，通過高精度質(zhì)譜分析，同時實(shí)現(xiàn)多個樣本蛋白組的定性和定量。
圖5 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)流程
4、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)流程中的特別之處——肽段富集
磷酸化肽段在細(xì)胞所有肽段中的比例很低，非磷酸化修飾肽段的大量存在會覆蓋磷酸化肽段信號，直接影響磷酸化蛋白質(zhì)組的檢測和定量。因此需要對磷酸化肽段進(jìn)行針對性富集，增加磷酸化蛋白質(zhì)組的通路及定量準(zhǔn)確性。磷酸化肽段富集常用的富集方法主要為固相金屬離子色譜(Immobilized metal affinity chromatography, IMAC)、金屬氧化物親和色譜(Metal oxide affinity chromatography, MOAC)以及利用磷酸化抗體特異性富集的免疫沉淀法。其中IMAC和MOAC富集方法應(yīng)用最廣。
IMAC原理：是利用磷酸基團(tuán)與固相化的Fe3+、Ga3+、Al3+、Cu2+等金屬離子的高親和力來富集磷酸肽。
MOAC原理：與IMAC相似，MOAC的主要親和位點(diǎn)也是金屬陽離子，但與IMAC不同的是，MOAC中金屬陽離子與相鄰的陰離子之間的化學(xué)鍵更堅(jiān)固，可以克服IMAC中金屬陽離子流失的問題。常用的MOAC試劑包括二氧化鈦(TiO2)、二氧化鋯(ZrO2)和四氧化三鐵(Fe3O4)等等。
圖6 IMAC（左）和MOAC（右）原理示意圖
5、磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用案例
案例一：磷酸化與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究[3]
英文標(biāo)題：Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets
中文標(biāo)題：磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了GSK3-PDX1軸作為糖尿病胰島的關(guān)鍵致病信號節(jié)點(diǎn)
發(fā)表期刊：Cell Metabolism
影響因子：29.0
組學(xué)技術(shù)：Label free定量蛋白質(zhì)組學(xué)+磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)
研究內(nèi)容：2型糖尿病(Type 2 diabetes, T2D)是一種以胰島素抵抗和β細(xì)胞功能障礙為特征的進(jìn)行性疾病。磷酸化可以調(diào)節(jié)葡萄糖刺激的β細(xì)胞胰島素分泌，但體內(nèi)糖尿病胰島的信號網(wǎng)絡(luò)如何重塑仍不清楚。本文對正常小鼠和肥胖糖尿病小鼠的胰島組織進(jìn)行采集，采用Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)和定量磷酸化修飾組學(xué)技術(shù)對其蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分析。結(jié)合生物信息學(xué)，獲得正常和糖尿病小鼠胰島蛋白和磷酸化蛋白質(zhì)組的信號網(wǎng)絡(luò)圖，從磷酸化角度探索調(diào)控胰島素分泌的關(guān)鍵信號通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSK3-PDX1軸是控制胰島素分泌的關(guān)鍵信號節(jié)點(diǎn)，抑制GSK3能恢復(fù)胰腺β細(xì)胞面對高糖處理時正常分泌胰島素的能力。
技術(shù)路線
GSK3-PDX1軸是控制胰島素分泌的關(guān)鍵信號節(jié)點(diǎn)
案例二：磷酸化與生物標(biāo)記物篩選[4]
英文標(biāo)題：Phosphoproteomic analysis of neoadjuvant breast cancer suggests that increased sensitivity to paclitaxel is driven by CDK4 and filamin A
中文標(biāo)題：新輔助治療乳腺癌的磷酸蛋白組學(xué)分析揭示影響紫杉醇敏感性的背后機(jī)制
發(fā)表期刊：Cell Metabolism
影響因子：16.6
組學(xué)技術(shù)：磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)
研究內(nèi)容：乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，腫瘤異質(zhì)性為乳腺癌的精準(zhǔn)診療帶來巨大挑戰(zhàn)。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)可以了解蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，揭示以激酶活性為特征的患者亞群，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和個性化治療提供重要支持。本研究對接受紫杉醇治療的her2陰性乳腺癌患者(N = 130)進(jìn)行了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，旨在尋找紫杉醇敏感性的候選生物標(biāo)志物。通過2個獨(dú)立的患者組(N = 218)篩選了11個候選生物標(biāo)志物，可以鑒定出具有高水平CDK4和細(xì)絲蛋白A(filamin A)特征的患者亞組。在機(jī)制上，CDK4調(diào)節(jié)細(xì)絲蛋白A的轉(zhuǎn)錄，細(xì)絲蛋白A可以與微管蛋白和CLIP-170形成復(fù)合物，導(dǎo)致微管的乙酰化和穩(wěn)定增加，使紫杉醇更容易結(jié)合到微管上。這些效應(yīng)相結(jié)合，導(dǎo)致了有高水平CDK4的腫瘤對這種藥物的敏感性增加，從而引發(fā)有嚴(yán)重后果的有絲分裂異常。
臨床試驗(yàn)治療和隊(duì)列設(shè)計(jì)
案例三：磷酸化與植物逆境脅迫研究[5]
英文標(biāo)題：Calcium-dependent activation of CPK12 facilitates its cytoplasm-to-nucleus translocation to potentiate plant hypoxia sensing by phosphorylating ERF-VII transcription factors
中文標(biāo)題：磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)揭示植物低氧感知新機(jī)理
發(fā)表期刊：Molecular Plant
影響因子：27.5
組學(xué)技術(shù)：磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)
研究內(nèi)容：鈣依賴性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases, CDPKs/CPKs)是植物應(yīng)激信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以通過磷酸化多種底物蛋白將鈣信號轉(zhuǎn)化為細(xì)胞反應(yīng)。然而，植物細(xì)胞在缺氧條件下傳遞鈣信號的分子機(jī)制尚不清晰。本研究通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥中CDPK家族成員CPK12，在缺氧時通過其Ser-186殘基的鈣依賴性磷酸化而迅速激活。磷酸化的CPK12從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，與磷酸化植物缺氧感應(yīng)的核心調(diào)控因子ERF-VIIs相互作用，增強(qiáng)其蛋白穩(wěn)定性，從而促進(jìn)植物對低氧脅迫的感知和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
實(shí)驗(yàn)流程
負(fù)向調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的CPK12轉(zhuǎn)運(yùn)
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6、參考文獻(xiàn)
[1] Spoel Steven H,Orchestrating the proteome with post-translational modifications.[J] .J Exp Bot, 2018, 69: 4499-4503.
[2] Roux Philippe P,Thibault Pierre,The coming of age of phosphoproteomics--from large data sets to inference of protein functions.[J] .Mol Cell Proteomics, 2013, 12: 3453-64.
[3] Sacco Francesca,Seelig Anett,Humphrey Sean J et al. Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets.[J] .Cell Metab, 2019, 29: 1422-1432.e3.
[4] Mouron S,Bueno M J,Lluch A et al. Phosphoproteomic analysis of neoadjuvant breast cancer suggests that increased sensitivity to paclitaxel is driven by CDK4 and filamin A.[J] .Nat Commun, 2022, 13: 7529.
[5] Fan Biao,Liao Ke,Wang Lin-Na et al. Calcium-dependent activation of CPK12 facilitates its cytoplasm-to-nucleus translocation to potentiate plant hypoxia sensing by phosphorylating ERF-VII transcription factors.[J] .Mol Plant, 2023, 16: 979-998.