蛋白質修飾大揭秘—磷酸化修飾蛋白質組學

1、蛋白質翻譯后修飾與磷酸化修飾的關系

蛋白質翻譯后修飾(Post-Translational Modifications, PTMs)是指在蛋白質合成完成之后，通過添加化學基團或蛋白質間的化學交互作用來改變蛋白質的結構和功能的過程。修飾作用可以改變蛋白質的電荷、空間結構、穩定性和親和性，從而調節蛋白質的功能、定位、相互作用和降解。PTMs增加了細胞蛋白質組的復雜性，為細胞提供了更多的功能和適應性。
在組成蛋白質的20種氨基酸中，至少15種氨基酸已被報道能夠發生修飾作用。同時，在同一種氨基酸上可以發生多種修飾。目前超過680種修飾類型被發現并報道，包括磷酸化(Phosphorylation)、泛素化(Ubiquitination)、類泛素化(Ubiquitin-like modification）、甲基化(Methylation)、乙?；?Acetylation)和糖基化(Glycosylation)等等。眾多的修飾類型進一步增加了蛋白質的復雜性，這使多種生物學過程及信號通路受到影響。

圖1 蛋白質翻譯后修飾的多樣性和復雜性^[1]

圖2 蛋白質磷酸化與其他修飾之間的Crosstalk^[2]

2、蛋白質磷酸化修飾主要特點

蛋白磷酸化是最常見的可逆PTMs，它是指在蛋白激酶的作用下，將ATP或GTP的磷酸基團轉移到底物蛋白質氨基酸殘基上的過程，其可逆過程指的是在磷酸酯酶作用下，將發生磷酸化修飾的蛋白質中的磷酸基團脫除下來的過程。

據報道，有超過500種激酶和100種磷酸（酯）酶參與了蛋白質磷酸化和去磷酸化過程，這一可逆過程與細胞信號傳導密切相關。研究發現，生物體的真核細胞中約有1/3的蛋白質發生磷酸化修飾作用，其中發生磷酸化修飾的位點主要集中在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上，其比例約為1800:200:1。

圖3 蛋白質磷酸化修飾形成過程

圖4 蛋白質磷酸化的重要功能^[2]

3、磷酸化蛋白質組學的定量分析方法

磷酸化蛋白質組學的定量方法主要有兩大類：非標記定量法和標記定量法。

（1）非標記定量法

非標記蛋白質組定量技術是一種不依賴于同位素標記的蛋白質定量技術，該技術通過液質聯用對蛋白質酶解肽段進行檢測，分析大規模鑒定蛋白質時所產生的質譜數據，常與數據非依賴采集(Data independent acquisition, DIA)或數據依賴采集模式(Data dependent acquisition, DDA)質譜掃描模式相結合。

（2）標記定量法

標記定量蛋白質組學技術是一種多肽體外標記定量技術。采用多種同位素的標簽，可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側鏈氨基）反應實現連接，通過高精度質譜分析，同時實現多個樣本蛋白組的定性和定量。

圖5 磷酸化蛋白質組學實驗流程

4、磷酸化蛋白質組學流程中的特別之處——肽段富集

磷酸化肽段在細胞所有肽段中的比例很低，非磷酸化修飾肽段的大量存在會覆蓋磷酸化肽段信號，直接影響磷酸化蛋白質組的檢測和定量。因此需要對磷酸化肽段進行針對性富集，增加磷酸化蛋白質組的通路及定量準確性。磷酸化肽段富集常用的富集方法主要為固相金屬離子色譜(Immobilized metal affinity chromatography, IMAC)、金屬氧化物親和色譜(Metal oxide affinity chromatography, MOAC)以及利用磷酸化抗體特異性富集的免疫沉淀法。其中IMAC和MOAC富集方法應用最廣。

IMAC原理：是利用磷酸基團與固相化的Fe3+、Ga3+、Al3+、Cu2+等金屬離子的高親和力來富集磷酸肽。

MOAC原理：與IMAC相似，MOAC的主要親和位點也是金屬陽離子，但與IMAC不同的是，MOAC中金屬陽離子與相鄰的陰離子之間的化學鍵更堅固，可以克服IMAC中金屬陽離子流失的問題。常用的MOAC試劑包括二氧化鈦(TiO2)、二氧化鋯(ZrO2)和四氧化三鐵(Fe3O4)等等。

圖6 IMAC（左）和MOAC（右）原理示意圖

5、磷酸化修飾蛋白質組學的應用案例

案例一：磷酸化與信號轉導研究^[3]

英文標題：Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets

中文標題：磷酸蛋白質組學揭示了GSK3-PDX1軸作為糖尿病胰島的關鍵致病信號節點

發表期刊：Cell Metabolism

影響因子：29.0

組學技術：Label free定量蛋白質組學+磷酸化修飾蛋白質組學

研究內容：2型糖尿病(Type 2 diabetes, T2D)是一種以胰島素抵抗和β細胞功能障礙為特征的進行性疾病。磷酸化可以調節葡萄糖刺激的β細胞胰島素分泌，但體內糖尿病胰島的信號網絡如何重塑仍不清楚。本文對正常小鼠和肥胖糖尿病小鼠的胰島組織進行采集，采用Label-free定量蛋白質組學和定量磷酸化修飾組學技術對其蛋白質進行鑒定和分析。結合生物信息學，獲得正常和糖尿病小鼠胰島蛋白和磷酸化蛋白質組的信號網絡圖，從磷酸化角度探索調控胰島素分泌的關鍵信號通路。結果發現，GSK3-PDX1軸是控制胰島素分泌的關鍵信號節點，抑制GSK3能恢復胰腺β細胞面對高糖處理時正常分泌胰島素的能力。

技術路線

GSK3-PDX1軸是控制胰島素分泌的關鍵信號節點

案例二：磷酸化與生物標記物篩選^[4]

英文標題：Phosphoproteomic analysis of neoadjuvant breast cancer suggests that increased sensitivity to paclitaxel is driven by CDK4 and filamin A

中文標題：新輔助治療乳腺癌的磷酸蛋白組學分析揭示影響紫杉醇敏感性的背后機制

發表期刊：Cell Metabolism

影響因子：16.6

組學技術：磷酸化修飾蛋白質組學

研究內容：乳腺癌的發病率逐年上升，腫瘤異質性為乳腺癌的精準診療帶來巨大挑戰。磷酸化蛋白質組學可以了解蛋白質的磷酸化狀態，揭示以激酶活性為特征的患者亞群，為精準醫學和個性化治療提供重要支持。本研究對接受紫杉醇治療的her2陰性乳腺癌患者(N = 130)進行了磷酸化蛋白質組學分析，旨在尋找紫杉醇敏感性的候選生物標志物。通過2個獨立的患者組(N = 218)篩選了11個候選生物標志物，可以鑒定出具有高水平CDK4和細絲蛋白A(filamin A)特征的患者亞組。在機制上，CDK4調節細絲蛋白A的轉錄，細絲蛋白A可以與微管蛋白和CLIP-170形成復合物，導致微管的乙?；头€定增加，使紫杉醇更容易結合到微管上。這些效應相結合，導致了有高水平CDK4的腫瘤對這種藥物的敏感性增加，從而引發有嚴重后果的有絲分裂異常。

臨床試驗治療和隊列設計

案例三：磷酸化與植物逆境脅迫研究^[5]

英文標題：Calcium-dependent activation of CPK12 facilitates its cytoplasm-to-nucleus translocation to potentiate plant hypoxia sensing by phosphorylating ERF-VII transcription factors

中文標題：磷酸化修飾蛋白質組學揭示植物低氧感知新機理

發表期刊：Molecular Plant

影響因子：27.5

組學技術：磷酸化修飾蛋白質組學

研究內容：鈣依賴性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases, CDPKs/CPKs)是植物應激信號傳導的關鍵調節因子，可以通過磷酸化多種底物蛋白將鈣信號轉化為細胞反應。然而，植物細胞在缺氧條件下傳遞鈣信號的分子機制尚不清晰。本研究通過磷酸化蛋白質組學分析，發現擬南芥中CDPK家族成員CPK12，在缺氧時通過其Ser-186殘基的鈣依賴性磷酸化而迅速激活。磷酸化的CPK12從細胞質轉運到細胞核，與磷酸化植物缺氧感應的核心調控因子ERF-VIIs相互作用，增強其蛋白穩定性，從而促進植物對低氧脅迫的感知和信號轉導。

實驗流程

負向調節缺氧誘導的CPK12轉運

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6、參考文獻

[1] Spoel Steven H,Orchestrating the proteome with post-translational modifications.[J] .J Exp Bot, 2018, 69: 4499-4503.

[2] Roux Philippe P,Thibault Pierre,The coming of age of phosphoproteomics--from large data sets to inference of protein functions.[J] .Mol Cell Proteomics, 2013, 12: 3453-64.

[3] Sacco Francesca,Seelig Anett,Humphrey Sean J et al. Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets.[J] .Cell Metab, 2019, 29: 1422-1432.e3.

[4] Mouron S,Bueno M J,Lluch A et al. Phosphoproteomic analysis of neoadjuvant breast cancer suggests that increased sensitivity to paclitaxel is driven by CDK4 and filamin A.[J] .Nat Commun, 2022, 13: 7529.

[5] Fan Biao,Liao Ke,Wang Lin-Na et al. Calcium-dependent activation of CPK12 facilitates its cytoplasm-to-nucleus translocation to potentiate plant hypoxia sensing by phosphorylating ERF-VII transcription factors.[J] .Mol Plant, 2023, 16: 979-998.