PPP在抗ROS活性和腫瘤侵襲上具有重大意義，其中間產物NADPH是鐵死亡的指標。為了明確KDM5C在ROS抗性和鐵死亡中的潛在作用，作者通過ROS誘導處理來比較各種ccRCC細胞系ROS抗性。與其他ccRCC細胞系相比，RCC4表現出相對較高的ROS抗性（圖6 A）。在用TBHP處理后，與RCC4-H514A細胞相比，RCC4-KDM5C有更多的細胞死亡（圖6 B）。同時，在TBHP誘導下，KDM5C導致ROS水平顯著增加（圖6 C）。此外，KDM5C顯著增強了Erastin介導的細胞死亡（圖6 B），這可以被Ferr-1或DFO有效逆轉，但不能被Z-VAD或Nec-1s逆轉。因此，與RCC4-H514A細胞相比，RCC4-KDM5C細胞中Erastin誘導的脂質過氧化增加更明顯（圖6 D）。

圖6. KDM5C主要通過抑制鐵死亡來抑制致瘤性

敲除KDM5C后，與幾種ccRCC細胞系對TBHP和Erastin的抵抗力顯著增強（圖7 A、B）。值得注意的是，在糖原磷酸化酶抑制劑(GPI)會抑制其抗性（圖7 C），這表明KDM5C蛋白介導的糖原重編程的缺失對于抗ROS和鐵死亡是必不可少的。

圖7. KDM5C的缺失使老化的腎細胞和ccRCC細胞對鐵死亡具有抗性

測序鑒定到大部分突變在JmjN和JmjC結構域中富集（圖8 A），為了評估這些癌癥相關的KDM5C突變對糖原積累和鐵死亡的影響，選擇了幾個JmjN和JmjC結構域相關的錯義突變，并構建了穩定表達突變蛋白的相應RCC4細胞系（圖8 A）。有趣的是，所有這些突變體都表現得像H514A，不能有效地降低糖原和G6P水平（圖8 B），并且它們都沒有使細胞對鐵死亡或ROS誘導劑敏感（圖8 C)。

圖8. 臨床相關的KDM5C突變體未能降低糖原水平并抑制鐵死亡

基于前面的結果，作者提出了ccRCC中失活KDM5C突變的模型。如圖9所示，雌性KDM5C有兩個活性等位基因；因此，在單個基因改變后，雌性不會完全喪失基因。相比之下，在男性中，一個腎細胞突變使KDM5C基因的唯一等位基因失活，從而可能通過增加糖原生成/糖原分解和抑制鐵死亡來促進腫瘤發生。因此，男性更容易患ccRCC。

圖9. 失活KDM5C突變和ccRCC發病模型

此外，ccRCC患者存活率較低可能與磷酸戊糖途徑(PPP)的上調有關，因此糖原代謝可以作為治療靶點，但是，ccRCC中糖原累積和相關致癌功能的遺傳因素尚不完全清楚。

本文利用全外顯子組與RNA測序評估KDM5C在ccRCC中的功能，結合靶標代謝流研究KDM5C如何影響細胞內代謝通量。同時還對小鼠進行KDM5C基因敲除收集更多的體內證據，揭示了組蛋白修飾基因失活突變重編程糖原代謝的機制，并有助于解決人類癌癥中男性占主導地位的長期難題。

對ccRCC 6個細胞系進行高碘酸-希夫 (PAS) 染色和糖原定量測定發現，相比于其他同樣缺乏 VHL基因的癌細胞系，RCC4表現出最高的糖原水平（圖1 A、B）。此外，外顯子測序結果表明RCC4細胞中KDM5C和VHL出現移碼和錯義突變，WB結果發現RCC4細胞中不存在KDM5C和VHL蛋白（圖1 C、D），由此表明癌細胞中的高糖原水平可能與KDM5C突變有關。

為了驗證KDM5C的恢復是否會降低RCC4細胞中的糖原水平，構建了野生型KDM5C或其酶失活突變體H514A的RCC4細胞系，PAS染色結果和糖原定量測定結果表明KDM5C能有效降低糖原水平（圖1 E、F），KDM5C突變促進ccRCC中糖原的形成。

鑒于KDM5C是X失活逃逸基因，作者分析不同性別的患者的情況，發現在ccRCC中頻繁突變的基因中，KDM5C突變表現出最高的男女比例（圖1 G），KDM5C蛋白水平在ccRCC患者中下降，同時糖原顯著增加（圖1 H），這就解釋了為什么ccRCC患者大部分為男性。

圖1. X失活逃逸基因KDM5C在糖原水平最高的ccRCC細胞系中具有移碼突變

為了證實KDM5C缺失導致ccRCC發生和糖原積累，作者進行KDM5C敲除實驗。在對照組中，雌性腎臟中的KDM5C蛋白水平高于雄性（圖2 A）。相比于對照組，在50%的KDM5C敲除小鼠中觀察到腎囊腫（圖2 B），其管腔的上皮細胞顯示出強Ki67染色（圖2 C），KDM5C敲除小鼠的腎小管表現出細胞質糖原累積升高（圖2 D）, 表明KDM5C缺失可能引發ccRCC特異性代謝表型并促進腫瘤形成。另外，KDM5C敲除穩定細胞系的PAS染色和糖原定量結果均表明KDM5C耗盡后糖原水平增加（圖2 E-H）。

圖2. KDM5C敲除引發ccRCC特異性代謝表型