質粒是基因工程的核心載體，高效攜帶外源基因，是基因與細胞治療、mRNA疫苗/藥物、DNA疫苗、重組蛋白、基因編輯等下游應用的基礎。據Grand View Research測算，2024年全球AAV基因治療藥物市場規模約10.2億美元，預計到2030年將達到27.78億美元，2025到2030年的CAGR高達18.5%。截至2025年4月10日，國內第一款AAV基因療法藥物獲批上市，另外還有40余款AAV基因藥物IND臨床獲批。隨著下游細分領域如AAV基因治療藥物、mRNA腫瘤疫苗等的快速發展，對質粒產能、通量、質量、交付效率等提出了更高的要求。

傳統質粒DNA生產主要依靠大腸桿菌發酵，面對各技術路線開發周期要求不斷提高，該方式已逐漸暴露弊端：

生產周期長：GMP級質粒交付周期通常超過2個月；

工藝復雜：針對不同需求（LVV、AAV、mRNA等）的質粒生產，細胞庫構建和發酵純化工藝驗證周期長；

雜質影響的不確定性：抗性基因、宿主蛋白/DNA殘留、細菌內毒素殘留等存在安全性風險；

穩定性差：在傳代培養過程中，發生基因重組概率高；

通量低：依靠發酵培養和層析純化技術，無法實現通量生產，難以滿足早研篩選需求。

生產周期短：2~3天內即可簡單快速擴大質粒規模

工藝簡單：酶促合成體系簡單，易于進行高通量合成

精度高：高保真擴增酶有效避免突變，無細胞內抗性基因干擾及代數擴增突變

Cell-free DNA制備流程

Cell-free DNA制備可分為兩個工藝路線：

基于Phi29 DNA聚合酶的滾環復制（RCA）路線：

基于TelN Protelomerase的doggybone DNA（dbDNA）制備路線：

mRNA疫苗在個性化腫瘤療法領域中的優勢明顯，各大RNA相關企業紛紛布局腫瘤疫苗管線。個性化癌癥疫苗因其量身設計和制造的特性，使其制備的過程中對GMP線性化質粒需求量相對較少，同時需要快速生產。Cell-free DNA合成技術僅在2~3天內就可以快速擴大生產規模，且設備小型，操作簡易靈活，成為非常適合個性化mRNA用質粒的生產方式。當使用Cell-free DNA進行mRNA模板制備，mRNA質量是否滿足標準要求呢？

近岸蛋白提供快速擴增Super Phi29 DNA聚合酶（目錄號：E012）、TelN Protelomerase（目錄號：M101）及全套mRNA合成用酶，經驗證，使用上述兩種Cell-free DNA合成工藝制備的mRNA模板，體外轉錄得到的mRNA產量、完整性及加帽率等各方面均符合要求。

擴增速度快，3h可完成擴增反應

圖例）同時對1ng模板進行擴增，近岸蛋白Super Phi29和N品牌產品在1h時均出現擴增條帶，3h完成擴增反應。

酶活高、靈敏度高

利用TelN酶及T5外切酶特性，在質粒中同時設計TelN酶和BsaI酶識別位點：經TelN酶切后成封閉末端的線性雙鏈DNA，不能被T5外切酶消化；再經BsaI切割后，產生新的非封閉末端，從而可以被T5外切酶消化。

RCA+IVT獲得符合要求的mRNA

圖例）通過RCA獲得長鏈DNA，10ng質粒投入獲得約30μg體外轉錄模板，有效進行模板放大。經限制性內切酶酶切獲得IVT模板，體外轉錄后得到的mRNA產量高，完整性好，且GGG起始模板與Cap1 GAG帽結構進行共轉錄，加帽率大于95%，總蛋白殘留未檢出。

 

dbDNA+IVT獲得符合要求的mRNA

圖例）通過RCA獲得長鏈DNA，10ng質粒投入獲得約10-30μg dbDNA，有效進行模板放大。經TelN酶/T5外切酶/限制性內切酶酶切獲得IVT模板，體外轉錄后得到的mRNA產量高，完整性好，且GGG起始模板與Cap1 GAG帽結構進行共轉錄，加帽率大于95%，總蛋白殘留未檢出。

 

值得注意的是，dbDNA技術源自英國Touchlight公司開發的專利體系，采用該路徑進行DNA生產可能涉及一定的專利費用，但這并不妨礙其技術在實際應用中的巨大潛力。尤其在以質粒為基礎的生物療法領域，如 AAV、LVV載體以及 DNA 疫苗中，dbDNA有望展現出突出的優勢。同時，以RCA技術為核心的Cell-free DNA制備，與mRNA藥物生產流程相結合，將為個性化腫瘤治療提供更高效、靈活的候選分子篩選方案，加速藥物開發進程。