質(zhì)粒是基因工程的核心載體，高效攜帶外源基因，是基因與細(xì)胞治療、mRNA疫苗/藥物、DNA疫苗、重組蛋白、基因編輯等下游應(yīng)用的基礎(chǔ)。據(jù)Grand View Research測(cè)算，2024年全球AAV基因治療藥物市場(chǎng)規(guī)模約10.2億美元，預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)到27.78億美元，2025到2030年的CAGR高達(dá)18.5%。截至2025年4月10日，國(guó)內(nèi)第一款A(yù)AV基因療法藥物獲批上市，另外還有40余款A(yù)AV基因藥物IND臨床獲批。隨著下游細(xì)分領(lǐng)域如AAV基因治療藥物、mRNA腫瘤疫苗等的快速發(fā)展，對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)能、通量、質(zhì)量、交付效率等提出了更高的要求。
行業(yè)需求“爆發(fā)”，傳統(tǒng)質(zhì)粒生產(chǎn)能否持續(xù)滿(mǎn)足需求？
傳統(tǒng)質(zhì)粒DNA生產(chǎn)主要依靠大腸桿菌發(fā)酵，面對(duì)各技術(shù)路線開(kāi)發(fā)周期要求不斷提高，該方式已逐漸暴露弊端：
生產(chǎn)周期長(zhǎng)：GMP級(jí)質(zhì)粒交付周期通常超過(guò)2個(gè)月；
工藝復(fù)雜：針對(duì)不同需求（LVV、AAV、mRNA等）的質(zhì)粒生產(chǎn)，細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建和發(fā)酵純化工藝驗(yàn)證周期長(zhǎng)；
雜質(zhì)影響的不確定性：抗性基因、宿主蛋白/DNA殘留、細(xì)菌內(nèi)毒素殘留等存在安全性風(fēng)險(xiǎn)；
穩(wěn)定性差：在傳代培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)生基因重組概率高；
通量低：依靠發(fā)酵培養(yǎng)和層析純化技術(shù)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)通量生產(chǎn)，難以滿(mǎn)足早研篩選需求。
無(wú)細(xì)胞（Cell-free）DNA制備或帶來(lái)下一個(gè)合成時(shí)代
Cell-free DNA制備技術(shù)是指在體外利用復(fù)制酶將質(zhì)粒模板進(jìn)行大量擴(kuò)增，從而獲得足量的DNA。該技術(shù)無(wú)需進(jìn)行多級(jí)細(xì)胞建庫(kù)和菌液發(fā)酵，生產(chǎn)周期短，反應(yīng)可控，在生產(chǎn)周期要求高，且需求量較少的應(yīng)用場(chǎng)景中優(yōu)勢(shì)凸顯，例如個(gè)性化藥物、毒性基因合成、無(wú)細(xì)胞蛋白合成等。
Cell-free DNA制備技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯
生產(chǎn)周期短：2~3天內(nèi)即可簡(jiǎn)單快速擴(kuò)大質(zhì)粒規(guī)模
工藝簡(jiǎn)單：酶促合成體系簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行高通量合成
精度高：高保真擴(kuò)增酶有效避免突變，無(wú)細(xì)胞內(nèi)抗性基因干擾及代數(shù)擴(kuò)增突變
Cell-free DNA制備流程
Cell-free DNA制備可分為兩個(gè)工藝路線：
基于Phi29 DNA聚合酶的滾環(huán)復(fù)制（RCA）路線：
基于TelN Protelomerase的doggybone DNA（dbDNA）制備路線：
當(dāng)mRNA遇上Cell-free DNA
mRNA疫苗在個(gè)性化腫瘤療法領(lǐng)域中的優(yōu)勢(shì)明顯，各大RNA相關(guān)企業(yè)紛紛布局腫瘤疫苗管線。個(gè)性化癌癥疫苗因其量身設(shè)計(jì)和制造的特性，使其制備的過(guò)程中對(duì)GMP線性化質(zhì)粒需求量相對(duì)較少，同時(shí)需要快速生產(chǎn)。Cell-free DNA合成技術(shù)僅在2~3天內(nèi)就可以快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，且設(shè)備小型，操作簡(jiǎn)易靈活，成為非常適合個(gè)性化mRNA用質(zhì)粒的生產(chǎn)方式。當(dāng)使用Cell-free DNA進(jìn)行mRNA模板制備，mRNA質(zhì)量是否滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)要求呢？
近岸蛋白提供快速擴(kuò)增Super Phi29 DNA聚合酶（目錄號(hào)：E012）、TelN Protelomerase（目錄號(hào)：M101）及全套mRNA合成用酶，經(jīng)驗(yàn)證，使用上述兩種Cell-free DNA合成工藝制備的mRNA模板，體外轉(zhuǎn)錄得到的mRNA產(chǎn)量、完整性及加帽率等各方面均符合要求。
數(shù)據(jù)展示
Super Phi29 DNA聚合酶
擴(kuò)增速度快，3h可完成擴(kuò)增反應(yīng)
圖例）同時(shí)對(duì)1ng模板進(jìn)行擴(kuò)增，近岸蛋白Super Phi29和N品牌產(chǎn)品在1h時(shí)均出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，3h完成擴(kuò)增反應(yīng)。
酶活高、靈敏度高
圖例）近岸蛋白Super Phi29具有較高的酶活性，較高倍數(shù)的稀釋仍然能夠擴(kuò)增1ng模板，同時(shí)，可以對(duì)pg級(jí)模板進(jìn)行擴(kuò)增。
TelN Protelomerase
TelN Protelomerase可以特異性的識(shí)別dsDNA上的telRL序列（56bp）切割dsDNA，并在切割位點(diǎn)形成共價(jià)封閉末端，有效地將環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)化為有封閉末端的線性DNA。
性能驗(yàn)證
利用TelN酶及T5外切酶特性，在質(zhì)粒中同時(shí)設(shè)計(jì)TelN酶和BsaI酶識(shí)別位點(diǎn)：經(jīng)TelN酶切后成封閉末端的線性雙鏈DNA，不能被T5外切酶消化；再經(jīng)BsaI切割后，產(chǎn)生新的非封閉末端，從而可以被T5外切酶消化。
使用Cell-free DNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄
RCA+IVT獲得符合要求的mRNA
圖例）通過(guò)RCA獲得長(zhǎng)鏈DNA，10ng質(zhì)粒投入獲得約30μg體外轉(zhuǎn)錄模板，有效進(jìn)行模板放大。經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切獲得IVT模板，體外轉(zhuǎn)錄后得到的mRNA產(chǎn)量高，完整性好，且GGG起始模板與Cap1 GAG帽結(jié)構(gòu)進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄，加帽率大于95%，總蛋白殘留未檢出。
dbDNA+IVT獲得符合要求的mRNA
圖例）通過(guò)RCA獲得長(zhǎng)鏈DNA，10ng質(zhì)粒投入獲得約10-30μg dbDNA，有效進(jìn)行模板放大。經(jīng)TelN酶/T5外切酶/限制性?xún)?nèi)切酶酶切獲得IVT模板，體外轉(zhuǎn)錄后得到的mRNA產(chǎn)量高，完整性好，且GGG起始模板與Cap1 GAG帽結(jié)構(gòu)進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄，加帽率大于95%，總蛋白殘留未檢出。
值得注意的是，dbDNA技術(shù)源自英國(guó)Touchlight公司開(kāi)發(fā)的專(zhuān)利體系，采用該路徑進(jìn)行DNA生產(chǎn)可能涉及一定的專(zhuān)利費(fèi)用，但這并不妨礙其技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的巨大潛力。尤其在以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的生物療法領(lǐng)域，如 AAV、LVV載體以及 DNA 疫苗中，dbDNA有望展現(xiàn)出突出的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，以RCA技術(shù)為核心的Cell-free DNA制備，與mRNA藥物生產(chǎn)流程相結(jié)合，將為個(gè)性化腫瘤治療提供更高效、靈活的候選分子篩選方案，加速藥物開(kāi)發(fā)進(jìn)程。
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