文章標題：Effect of Fushengong Decoction on PTEN/PI3K/AKT/NF-κB Pathway in Rats With Chronic Renal Failure via Dual-Dimension Network Pharmacology Strategy
發表期刊：Frontiers in Pharmacology
影響因子：5.81
合作單位：重慶醫科大學
百趣生物提供服務：中藥非靶標代謝組學
1研究背景
慢性腎功能衰竭（CRF）是一種由多種原因導致腎功能進行性喪失并最終導致腎功能衰竭的疾病。近年來，CRF因其病情危重、發病率和死亡率高，已成為不可忽視的重大公共衛生問題。研究發現CRF的發病機制可能與遺傳因素、血液動力學變化、炎癥因子、氧化應激等密切相關。CRF的主要治療方法是腎移植和血液透析，但療效較差。
復腎湯（FSGD）是國醫大師郭子光教授經60余年的臨床創制的經驗方。其作用是補腎、活血、化濁，改善腎功能和腎纖維化。本文作者課題組先前的研究表明FSGD可以顯著降低α-SMA和TGF-β1的表達水平，從而減少腎纖維化。盡管FSGD在CRF中的臨床應用已經得到驗證，但由于其成分和靶點的復雜性，其治療CRF的機制尚不清楚。
重慶醫科大學黃學寬課題組羅洪玉在相關研究中，利用網絡藥理學和UHPLC-MS/MS技術，對FSGD治療CRF的有效成分及其作用機制進行預測，并結合體內實驗進一步證實PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學信號通路是FSGD治療GRF的關鍵通路。
圖1. FSGD在GRF中的研究示意圖
2研究設計
將雄性SD大鼠(200±20g)隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（NDQ）、FSGD組。用腺嘌呤建立CRF動物模型，然后FSGD治療4周。收集血清和尿液樣本，檢測代謝生化指標以評估腎功能。通過對腎臟組織進行蘇木精-伊紅染色和馬松染色實驗來評價腎臟病理損傷程度。采用免疫組織化學和蛋白印跡分析檢測蛋白的表達水平。
3研究結果
（1）FSGD的藥用活性成分及相關靶點
從TCMSP數據庫中檢索到121個FSGD藥用成分。以OB≥30%、HL≥4和DL≥0.18為篩選標準。將符合篩選標準的藥用成分進行進一步分析，在FSGD中預測得到893個假定靶點。
（2）CRF靶點預測和共有靶點
從GeneCards數據庫中總共獲得8596個CRF 靶點。其中1115個靶點可以作為候選治療靶點。將 FSGD 的靶點與 CRF 的靶點進行比對并繪制維恩圖，發現192 個共有靶點，例如 EGFR、TNF和AKT1(圖2A)。第一維共同靶點被認為是FSGD 抗CRF的潛在治療靶點。
（3）GO和KEGG富集分析
經GO分析，發現炎癥反應、凋亡信號通路和細胞外基質參與了CRF的過程(圖2B)。在KEGG通路富集化分析位于前15的信號通路中，PTEN/PI3K/AKT/NF-κB參與慢性腎功能衰竭過程中細胞的凋亡與增殖、炎癥和纖維化(圖2C)。先前研究表明，FSGD可通過RAS系統中的ACE-Ang II-AT1R軸改善CRF大鼠的腎功能，抑制腎纖維化，而RAS與肝臟中的PI3K/AKT通路密切相關。據此，作者推測FSGD治療CRF的機制可能是通過調節PTEN/PI3K/AKT/NF-κB信號通路。
（4）FSGD治療GRF理論活性成分一維網絡可視化
利用192個共有靶點構建PPI網絡，PPI網絡分析表明STAT3,PIK3CA,PIK3R1,MAPK1,SRC和AKT1是PPI網絡中前六大靶基因。其中PIK3CA,PIK3R1和AKT1與PTEN/PI3K/AKT/NF-κB通路有關，AKT1是關鍵基因(圖2D-E)
圖2. FSGD在GRF中的第一維網絡藥理學研究
（5）UHPLC-MS/MS檢出有效成分的第二維網絡藥理學分析
FSGD正/負總離子流圖展示了該湯劑所有化合物的化學成分，經過與中藥系統藥理學數據庫收集的有效化合物比對出40種化合物。使用前面的篩選標準篩選出9個候選化合物，并預測了它們的靶標(圖3A-C)，然后進行了第二維網絡藥理學分析。PPI結果表明，AKT1是該網絡的最高靶基因和中心基因。此外，GO、KEGG和PPI的結果都參與了PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學通路(圖4A-D)。
圖3. 超高效液相色譜串聯質譜(UHPLC-MS/MS)鑒定FSGD水提取物溶液中的化學成分
圖4. CRF中FSGD檢測成分的第二維網絡藥理學研究
（6）FSGD對腎功能的保護作用
通過24h尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮檢測腎功能。與正常組相比，模型組大鼠24h尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮均顯著升高，表明本實驗成功建立了CRF大鼠模型。然而，FSGD和NDQ顯著降低了這些CRF指標，且FSGD組改善顯著(圖5A-C)。結果表明，FSGD可以改善CRF癥狀和腎功能。
圖5. FSGD對腎病理性損傷和腎纖維化的影響
（7）FSGD減輕腎臟病理損傷和腎纖維化
與正常組相比，模型組大鼠腎臟病理形態發生顯著改變，腎小管擴張或萎縮，大量炎性細胞浸潤，腺嘌呤結晶沉積阻塞管腔。同時，NDQ和FSGD可減輕上述病理損傷。經Masson染色，與對照組相比，模型組大鼠腎組織中膠原纖維顯著累積，FSGD顯著改善腎纖維化(圖5D-E)。
（8）FSGD對慢性腎衰模型PI3K/AKT信號轉導通路的影響
免疫組化檢測結果發現模型組PTEN表達顯著降低，而FSGD組PTEN表達顯著升高(圖6A-B)，表明PTEN表達主要受PI3K/AKT通路調控。免疫組化分析發現，模型組腎組織中PI3K、AKT、p-AKT表達均顯著升高，FSGD和NDQ顯著上調PTEN的表達，提示降低PI3K、AKT和p-AKT的表達是通過抑制 PI3K/AKT通路實現的(圖6C-E)。
為了驗證上述假設，作者使用蛋白印跡分析進一步檢測了腎臟中的關鍵因子PTEN及其上游因子PI3K和p-PI3K的蛋白水平。與正常組比較，模型組大鼠PTEN表達顯著降低，FSGD和NDQ治療后PTEN表達顯著增加(圖7A-D)。此外，在模型組PI3K和p-PI3K的表達顯著增加，而FSGD和NDQ處理組與模型組相比，PI3K和p-PI3K的表達顯著降低(圖7A-D)。
為了進一步揭示FSGD在PTEN/PI3K/AKT/NF-κB通路中的作用機制，作者測定了下游因子AKT、p-AKT和NF-κB，因為這些因子在腎纖維化中起著重要作用。與正常組相比，模型組腎組織中AKT、p-AKT和NF-κB的表達顯著增加，表明腎組織中PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學通路被激活，而FSGD和NDQ處理后腎組織中AKT、p-AKT和NF-κB的表達顯著降低(圖7E-H)，說明FSGD和NDQ處理能夠抑制PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學通路。
圖6. FSGD對PI3K/AKT通路的影響
圖7. PI3K/AKT通路蛋白分析
圖8. FSGD治療CRF分子調控示意圖
4總結
綜上所述，作者本研究中進行系統地鑒定了FSGD中包含的成分，并通過二維網絡藥理學和體內實驗研究了FSGD治療CRF的分子調控機制。本研究結果表明，FSGD減輕CRF大鼠腎纖維化和腎損傷的作用可能與抑制PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代謝組學信號通路有關。網絡藥理學是探索復雜疾病機制和藥物多靶點的新策略，可以幫助中藥研究人員更準確地找到最可能的藥物治療機制，為進一步的實驗提供更充分的理論基礎。
文/阿趣代謝組學