文章標題：Senescence Cell Induction Methods Display Diverse Metabolic Reprogramming and Reveal an Underpinning Serine/Taurine Reductive Metabolic Phenotype
發表期刊：Aging Cell
影響因子：7.1
研究背景
細胞水平生物分子損傷的全身積累是衰老核心，而衰老細胞表型以不可逆生長停滯為特征，伴隨端粒縮短、DNA 損傷、活性氧升高、線粒體功能障礙等標志。衰老細胞在組織中積累會破壞組織功能、引發神經退行性疾病、心血管疾病等，并通過細胞結構增大/硬化、自噬受損及分泌衰老相關分泌表型（SASP）等促進退行性變化。
現有多種體外方法研究衰老細胞生物分子變化，如檢測 p16/Rb、p21/p53、SA-β-Gal 活性等；基于質譜的代謝物/蛋白質分析、穩定同位素示蹤等技術，結合細胞變形性研究，在解析衰老相關分子失調、挖掘治療靶點方面潛力巨大。
本研究開發多組學形態流變學平臺，以 HFF-1 成纖維細胞為模型，通過復制傳代、輻射、化學藥物（羥基脲、依托泊苷）處理生成不同衰老誘導模型，后續分析整合代謝組學、蛋白組學及流變學數據，結合穩定同位素示蹤，探究衰老相關代謝重編程方向。
研究結果
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人成纖維細胞衰老誘導及衰老相關β-半乳糖苷酶表達
選用人成纖維（HFF-1）細胞，通過多次傳代構建復制性衰老模型；同時用不同劑量 X 射線（引發 DNA 損傷）、羥基脲（抑制 DNA 合成）、依托泊苷（誘導 DNA 損傷）處理，構建應激誘導衰老模型。
以 “細胞活力約 50%、衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）陽性細胞超 50%” 為標準優化模型后，確定后續分析參數：復制性衰老選用 20 代細胞，應激衰老分別選用 12 Gy X 射線照射、800 μM 羥基脲、10 μM 依托泊苷處理。優化后檢測顯示，20 代細胞與羥基脲處理組 SA-β-Gal 陽性率約 80%，輻射與依托泊苷處理組陽性率超 60%，符合有效衰老模型標準。
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衰老誘導表型的細胞變形能力與大小
為研究各方法誘導的細胞形態變化，該研究采用實時變形性流式細胞術（Real-Time Deformability Cytometry, RT-DC）測量細胞體積和變形能力（圖 1）。微流控室設計可測量儲液池中細胞初始形狀及變形通道中的變形（圖 1A-B）。結果顯示，與對照組相比，20 代細胞、12 Gy 照射、800 μM 羥基脲、10 μM 依托泊苷處理組細胞面積均顯著更大（圖 1C）。其中早期傳代（P3）與晚期傳代（P20）細胞面積差異最顯著；羥基脲處理組大小變異最小。所有測試條件在變形通道中變形能力均有顯著差異；儲液池中傳代和照射組機械變形能力無顯著差異，依托泊苷和羥基脲處理組有顯著差異，表明不同衰老誘導方法會產生多種機械細胞表型。
圖1. 實時變形性流式細胞術對不同衰老模型進行形態流變學分析
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衰老相關的 DNA 損傷和細胞周期活性分子標志物
為明確各模型衰老的細胞內生物分子機制，研究分析 20 代細胞、12 Gy 照射、800 μM 羥基脲及 10 μM 依托泊苷處理細胞的分子標志物（γH2AX、Ki67、p21）。免疫定量分析顯示（圖 2A）：所有衰老誘導條件下，HFF-1 細胞 γH2AX 灶（DNA 雙鏈斷裂標志物）水平均升高，其中 20 代細胞與 12 Gy 照射組較對照組約增加 300%，800 μM 羥基脲與 10 μM 依托泊苷兩種藥物處理組則增加超 500%；Ki67 陽性細胞（細胞增殖標志物）中，20 代、12 Gy 照射及 10 μM 依托泊苷組較對照組顯著降低，僅羥基脲組略增約 20% 且該差異無統計學意義；p21 陽性細胞（細胞周期調控蛋白）中，高傳代和化學處理組增加 10%-20%，其中 20 代、12 Gy 照射及 10 μM 依托泊苷組與對照組的差異顯著，羥基脲組則無顯著差異。
進一步分析表明，高傳代、照射及依托泊苷處理細胞中，γH2AX 灶表達增強與細胞周期階段改變及增殖速率降低相關，而羥基脲處理細胞未表現出這種關聯（圖 2B）。
圖2. 衰老誘導的正常 HFF 細胞中 γH2AX、Ki-67 及 p21 陽性細胞核的免疫檢測
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衰老誘導表型的代謝譜分析
為研究不同衰老模型的整體代謝變化，對經各種誘導處理的 HFF-1 細胞進行非靶標代謝組學分析。結果顯示，所有處理組與對照組的代謝特征均明顯分離（圖 3A）。其中，20 代細胞中顯著差異代謝物為天冬酰胺和檸檬酸，均呈下調趨勢；照射處理細胞中為葡萄糖酸和鄰苯二甲酸二（2 - 乙基己基）酯；羥基脲處理細胞中顯著差異代謝物為 O-乙酰肉堿；依托泊苷處理細胞中為3-甲基-2-氧代戊酸（圖 3B）。氨基酸是所有條件下變化最顯著的類別，其中絲氨酸和?；撬崾д{最為突出 —— 所有處理組中絲氨酸均上調，?；撬峋抡{；此外，脂質相關代謝物脫氧肉堿在所有處理組中也均呈下調趨勢（圖 3C）。對細胞培養上清液（培養基）的代謝物分析顯示，20 代（高傳代）和依托泊苷處理組苯丙氨酸下調，照射和羥基脲組則上調；20 代、照射和依托泊苷組色氨酸水平較低，羥基脲組色氨酸升高。這表明氨基酸代謝失調在各種衰老誘導方法中高度保守，是衰老細胞共有的代謝特征之一。
圖3. 不同衰老誘導方法導致的代謝通路失調存在顯著差異
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衰老誘導表型的蛋白質組學分析
對經所有誘導方處理的 HFF-1 細胞進行蛋白質組學分析，同代謝組學分析類似，重點探究差異蛋白質表達水平及蛋白質功能分類。所有衰老誘導方法中，處理組與對照組的蛋白質表達特征均明顯分離（圖 4A）。
熱圖顯示，各組共同的顯著差異蛋白質涉及多類功能，包括參與細胞器生物發生與運輸（如 TUBB、TUBB4B）、核膜重組（如 RAN）、Rho GTPases 信號傳導（如 CAVIN1），以及參與代謝過程（如 ATP5F1A、ENO1）和免疫系統中細胞因子信號傳導（如 VIM、FSCN1）的蛋白質（圖 4B）。通路分析表明，所有條件下共有的顯著通路為 JAK–STAT 通路（其相關介質蛋白已知可減弱細胞衰老和 SASP）和白細胞介素 12 信號通路（其相關蛋白已知是 SASP 中的主要成分）。具體到各組，20 代傳代細胞無特異性富集的單獨通路；照射處理細胞的差異蛋白質顯著富集于細胞器生物發生相關通路；羥基脲處理細胞最顯著的通路與細胞應激反應相關；依托泊苷處理細胞的注釋蛋白質顯著富集于 NF-κB 和 Toll 樣受體信號通路。
圖4. 人包皮成纖維細胞（HFF-1）蛋白質特征的無標記蛋白質組學分析
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多組學數據整合及已鑒定代謝途徑的同位素示蹤
為深入了解衰老誘導時的代謝途徑變化，研究通過 MetaboAnalyst 軟件開展聯合通路分析，整合各測試條件（20 代傳代、12 Gy 輻射、800 μM 羥基脲、10 μM 依托泊苷）下的重要蛋白質組學（關鍵酶表達）與代謝組學（代謝物水平）數據。結果顯示，不同誘導方法富集的通路存在顯著差異：傳代和輻射處理細胞均涉及糖酵解通路，其中傳代細胞還涉及戊糖磷酸途徑，輻射細胞涉及苯丙氨酸代謝；羥基脲處理細胞顯著富集谷胱甘肽代謝和精氨酸代謝；依托泊苷處理細胞以纈氨酸、亮氨酸等支鏈氨基酸代謝變化為特征。
同位素示蹤分析（圖 5）進一步驗證了衰老誘導后葡萄糖和谷氨酰胺的代謝流向差異：傳代細胞中，¹³C-葡萄糖標記碳向檸檬酸的摻入量減少，而¹³C-谷氨酰胺標記碳向檸檬酸的摻入量增加，提示三羧酸循環中谷氨酰胺替代葡萄糖作為碳源供能；輻射和羥基脲處理細胞呈現類似趨勢，均表現為¹³C-葡萄糖向檸檬酸摻入減少、¹³C-谷氨酰胺向檸檬酸摻入增加；依托泊苷處理細胞則無此碳摻入重排，即¹³C-葡萄糖與¹³C-谷氨酰胺向三羧酸循環關鍵代謝物的標記碳摻入均未出現顯著調整。
圖5. 穩定同位素分析證實存在多種不同的代謝轉換過程
研究小結
該研究通過整合實時變形性流式細胞術（RT-DC）、非靶標代謝組學、蛋白質組學及同位素示蹤等多技術分析，明確不同衰老誘導方法（20 代傳代、12 Gy 輻射、800 μM 羥基脲、10 μM 依托泊苷）會產生各異的細胞生物分子譜，顯著影響細胞流變形態、代謝及蛋白質組，且不同誘導方法不可互換。所有誘導方法均存在代謝失調，衰老樣細胞代謝傾向絲氨酸 / ?；撬徇€原途徑，同時通過谷氨酰胺替代葡萄糖供能以減少氧化應激。但研究僅使用 HFF-1 細胞系，需進一步探究不同細胞系中結果的保守性；而記錄的代謝物差異（如絲氨酸上調、?；撬嵯抡{等），可為開發針對代謝氧化還原回路（尤其是絲氨酸 / ?；撬岽x相關 redox 平衡）的抗衰老及相關疾病療法提供依據。