肝細胞負責糖異生、尿素循環、藥物代謝等關鍵代謝，是肝臟的主要功能細胞。肝功能衰竭直接導致代謝性肝病。但目前為止缺乏能夠重現代謝功能的原代人肝細胞（PHH）模型。

傳統的肝細胞“三明治培養法”無法實現肝細胞的長期擴增，而基于小分子抑制劑的培養法可能引起膽管分化（即“脂肪變性”，高功能性細胞被重編程為具有增殖能力的細胞）?，F有的類器官培養技術可從小鼠成體肝細胞和胎兒肝母細胞中獲得體外3D自組織模型，擁有與來源組織近似的分子特性與結構組成，但缺乏確保成體PHH長期擴增同時保留生理功能的培養方案。

2025年4月16日，日本慶應義塾大學醫學院Toshiro Sato團隊在頂刊Nature上發表論文“Generation of human adult hepatocyte organoids with metabolic functions”，首次成功開發了一種能夠長期維持人成年肝細胞代謝功能的類器官培養系統，克服了人成年肝細胞在體外培養中面臨的長期自我更新與代謝功能的復刻兩大難題，在基因編輯和疾病建模中具有強大潛力。

研究團隊首先使用癌癥基因組圖譜 (TCGA) 數據集分析發現，WNT、Ras、TGFβ、STAT3和PKA等信號通路的改變與肝細胞癌的發生密切相關。在此基礎上，他們設計了一種包含EGF、HGF、FGF-10、Wnt/R-spondin、TGFβ家族抑制劑（A83-01和Noggin）、IL-6和PKA激活劑（forskolin）的培養基，用于促進肝細胞的長期擴增。

實驗結果表明，這種擴增培養基能夠高效地形成表達肝細胞標志物（如白蛋白和HNF4α）的小囊狀類器官（人肝細胞類器官，HHOs）。獲得的HHOs能夠在體外長期培養，且在形態上與肝細胞相似，表現出良好的增殖能力。

戒斷篩選實驗顯示，Wnt/R-spondin、EHF、TGFβ抑制劑和IL-6是生長支持因子。Noggin和forskolin則對長期穩定性至關重要。需要注意的是，肝內膽管細胞類器官(ICOs) 生長速度較快，可能與HHOs爭奪生態位，因此需要根據形態學進行人工去除。

圖1：基于細胞因子的HHOs的擴增

以上培養基可維持HHOs擴增2-3個月，但其增殖速度在1個月左右已經開始減慢。有鑒于IL-6（一種可激活STAT3的細胞因子）可以促進HHOs增殖，研究人員篩選了同類激活因子，發現oncostatin M（OSM）對細胞擴增的作用最強。

OSM可驅動HHO的上皮樣基底極性，同時與富含層粘膠蛋白的細胞外基質（Matrigel）相互作用，共同促進HHOs增殖（以指數方式繁殖至少3個月，并在6個月內保持其生長）。此外，OSM還維持了其肝細胞特性，防止了導管化生。

圖2：OSM-STAT3促進HHOs的穩定擴增

除OSM外，研究人員接下來發現，YAP信號也通過不同的機制誘導HHO擴增，但這種刺激并非不可或缺。阻斷YAP信號對HHO增殖的影響很小。不過，由LATS抑制劑（LATSi）激活的YAP協同增強了HHO與OSM的增殖，導致類器官在3-4周內增殖超過一百萬倍。另一方面，YAP和TGFβ靶基因還可能促進導管化生（膽管細胞樣特征的出現）。而OSM則能夠阻斷YAP信號活性、抑制限制肝細胞增殖的TGFβ靶基因的表達，從而促進肝細胞擴張并防止導管化生。

以上結果表明，LATSi與OSM可以協同促進HHOs增殖最大化。

在使用更昔洛韋治療的肝細胞衰竭的TK-NOG小鼠中，來自于年輕供體（2歲以下）的HHOs比原始PHH顯示出更高的定植效率。

如前所述，LATSi處理使HHO在3周內擴增百萬倍，但導致再生效率下降，這表明累積增殖阻礙了再生潛力，這可能與擴增過程中端粒縮短有關。

圖3：HHOs在小鼠體內的肝臟再生

在擴增培養基的基礎上，研究人員進一步優化了分化培養基，通過去除細胞因子OSM、WNT/R-spondin及Noggin、引入激素（生長激素、催乳素和皮質醇）和γ分泌酶抑制劑（DAPT）的混合物，成功誘導HHOs分化為具有代謝功能的成熟肝細胞類器官（dHHOs）。

圖4：具有代謝功能的dHHOs的建立

主成分分析（PCA）顯示，dHHOs具有與PHH整體轉錄組的相似性。轉錄組學分析也顯示，dHHOs具有與PHH代謝功能相關的基因表達模式，包括膽汁酸分泌、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、藥物代謝、糖異生和尿素循環等。

具體而言，與擴增HHO（eHHO）相區別，dHHO 中存在微管系統，可合成膽汁酸、并產生甘油三酯（無論是否補充 Wnt/R-spondin）。在長期擴增（超過90天）中，HHO中的甘油三酯生成能力和脂質積累保持完好，證明其具有肝細胞特異性的脂質代謝。

dHHO還具有重現藥物吸收和代謝的能力，可用于藥物在肝細胞中的毒性評估。此外，dHHOs還能夠進行糖異生和尿素循環，這在體外培養的肝細胞模型中是難以實現的。其甚至具備產生血漿白蛋白的能力（生成率為每百萬細胞 50 至 150 μg 天^-1，與人體內的估計生成率每百萬細胞 37-105 μg 天^-1相當），也是長期培養的人肝細胞模型的重大突破。

圖5：dHHOs的代謝特征

對PHH進行基因工程改造可以增進對肝臟疾病的了解，但此前相關工作一直存在挑戰。本文中，研究人員建立了HHO 的基因編輯工作流程，解決了電穿孔效率低、基因工程改造后的生長停滯和導管化生三個難題，改良了電穿孔條件，并加入LATSi和人血小板裂解物以使基因編輯的類器官有效擴增，與此同時并不會出現早期生長停滯。

總而言之，HHOs可以作為一種穩定且可操作的基因編輯平臺，用于研究肝臟疾病和開發治療策略。

圖6：基因敲除的HHOs

本研究開發的系統首次實現了人成年肝細胞的體外長期自我更新，并同時保持了其代謝功能，克服了以往培養方法的局限性。

HHOs在基因編輯和疾病建模方面的成功應用也為研究肝臟疾病的分子機制和開發新的治療策略提供了有力的工具。

參考資料

1. Igarashi, R., Oda, M., Okada, R. et al. Generation of human adult hepatocyte organoids with metabolic functions. Nature (2025).