概述
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噬菌體T7 RNA聚合酶（T7 RNA Polymerase，T7 RNAP）于1970年首次從噬菌體T7感染的大腸桿菌細胞中分離出來，是催化RNA合成的最簡單的酶之一。T7噬菌體是一種中等大小的噬菌體，其線狀雙螺旋DNA由39, 936 bp組成。39, 936 bp T7線性基因組的關鍵基因可以分為三大類，并且這三大類基因在T7感染周期的不同階段進行表達：I類基因在感染早期表達，為噬菌體生長建立有利條件；II類是主要參與DNA復制、蛋白編碼的基因；III類基因則在噬菌體生長的后期表達，主要編碼結構基因。多年來，T7 RNAP已廣泛應用于原核生物和真核生物中的高水平基因表達，并在生物學其他領域的應用得到擴展，例如RNA干擾、RNA編輯、合成基因電路、構建Vaccinia / T7混合系統等（如圖1）。如在工業生物技術中，基于T7 RNAP的表達系統，研究者開發出谷氨酸棒桿菌MB001和大腸桿菌BL21（DE3）兩個底盤菌株。由于T7 RNAP在原核環境中產生，因此T7 RNA聚合在真核環境中表達會遇到以下三種困難：i）mRNA加工，ii）加帽，iii）甲基化，和iv）真核環境中的多腺苷酸化。
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圖1: T7RNAP 在生物領域的多方面作用[1]
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特征
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T7 RNAP 具有許多有趣的特性：
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(1) 與多亞基原核和真核RNA聚合酶相比，它是一種單亞基酶[2]，
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(2) 對T7啟動子具有高度特異性；但對無關的DNA甚至T3啟動子不起作用[3]，
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(3) 不需要任何額外的蛋白質因子來完成完整的轉錄[4]，
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(4) T7 RNAP表現出有效的伸長率。它的伸長速度比大腸桿菌RNA聚合酶快約五倍，并產生非常長的轉錄本[5]，
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(5) 只能通過I 類和 II 類終止信號來執行轉錄終止，并且它獨立于大腸桿菌RNA聚合酶的轉錄終止因子[6, 7]。
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這些特性增加了這種酶的優勢，因此被廣泛應用于在 T7 啟動子的控制下表達異源基因，用于體內和體外實驗。
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結構與功能
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T7 RNA聚合酶由883個氨基酸構成，蛋白質分子量為99 kDa，在20世紀80年代早期，已有研究者確定其一級結構。該多肽在結構上與含有單亞基DNA聚合酶和RNA聚合酶的核苷酸聚合酶家族相似，例如大腸桿菌DNA聚合酶I和逆轉錄酶。T7 RNAP由N-末端結構域（殘基1-325）和聚合酶結構域（殘基326-883）組成（見圖2a）。T7 RNAP 結構的聚合酶結構域類似于右手，類似于其他核酸聚合酶結構。在催化中心具有 Mg2+ 離子的 T7 RNAP 的三維模型結構如圖 3b 所示。聚合酶結構域可以分為表示為拇指（殘基326-411），手掌（殘基412–449，528–553，785–879）和手指（殘基554–739，769–784）子結構域。由兩個亞結構域形成的間隙是DNA模板的結合位點。針對啟動子和聚合酶復合物的晶體結構的研究指出，N-末端結構域（殘基1-325）的兩個主要區域在序列特異性啟動子結合和打開雙鏈 DNA 中發揮著重要作用。
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圖2：T7 RNA聚合酶的結構[8]
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(a) T7 噬菌體基因組的主要基因產物和具有主要亞結構域的 T7RNAP 的結構域結構；(b) T7RNAP模型結構：顏色表示如下，N端域(1-325):黃色；拇指(326-411): 綠色; 手掌(412–449, 528–553, 785–879): 深藍; 手掌插入模塊 (450–527):淺藍; 手指(554–739, 769–784): 橙色；特異性loop (740–769): 粉紅色；extended foot module(838–879): 青色；C-末端結構域(880–883): 紫色。活性位點的兩個金屬離子顯示為綠色球體。
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T7 RNAP可催化從5’到3’方向的RNA合成。T7 RNAP對T7噬菌體啟動子具有高度的特異性，通過識別特定的T7啟動子序列并啟動轉錄過程，利用ATP、CTP、GTP與UTP這四種天然核苷酸作為底物，通過與DNA模板堿基配對，按照堿基互補配對原則合成RNA。T7 RNAP需要DNA模板和鎂離子（Mg2+）作為輔因子共同參與RNA的合成過程。牛血清蛋白及精胺對T7 RNAP具有促進效果。其與細菌的RNA聚合酶的差異之一，在于T7 RNA聚合酶不受抗生素立泛霉素的抑制。
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圖3：體外轉錄過程[8]
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改造
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雖然T7 RNAP廣泛應用于RNA的體外合成、體內蛋白表達（細菌高表達系統）等，但除了轉錄高效、延伸能力強等優點外，其作為體外RNA合成工具也存在一些不可忽略的缺點。T7 RNAP在合成RNA的過程中可能會產生許多的副產物，包括轉錄起始過程中產生的寡核苷酸、終止信號造成的中斷RNA產物、依賴RNA的RNA聚合酶活性造成的3’末端延伸產物等。因而，急需優化改進T7 RNAP，使其不僅能維持高效轉錄，同時也能夠降低RNA產物不均一的問題?，F有技術中，中國授權**CN 102177236 B提供了功能改善的RNA聚合酶突變體，通過將構成野生型T7 RNAP的氨基酸序列中的786位的谷氨酰胺、179位的賴氨酸以及685位的纈氨酸中的至少1個位置的氨基酸殘基替換為其它氨基酸，提高了這種T7 RNAP突變體的熱穩定性和/或比活性。中國**申請CN 107460177 A提供了可利用化學修飾核苷酸的RNA聚合酶突變體，通過將構成野生型T7 RNAP的氨基酸序列中的632位的精氨酸替換為半胱氨酸，大大提高了T7 RNAP轉錄活力。美國也有一些**對野生型T7 RNAP進行了改造，例如美國**US6524828B1通過使T7 RNA聚合酶核苷酸序列的第1897位發生T→C定點突變，導致所述T7 RNAP的氨基酸序列的第633位絲氨酸變為脯氨酸，這種方法增加了RNA聚合酶突變體的穩定性。
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類型
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T7 RNA聚合酶可分為：常規型和耐熱型。常規型T7 RNA聚合酶可在37℃對模板進行高效體外轉錄，而耐熱型T7 RNA聚合酶可在更高的溫度下進行體外轉錄?；诖四蜔岬捏w外轉錄反應特性具有以下優勢：
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（1）提升了GC含量較高RNA的轉錄效率；
（2）提升了長片段RNA的合成能力；
（3）在使用帽類似物時，提高了共轉錄的加帽效率；
（4）減少了dsRNA 副產物的形成，降低了合成RNA的免疫原性。
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近岸蛋白轉錄試劑盒（貨號：E131）高度特異識別T7啟動子序列，能夠轉錄不同大小的片段（如圖4所示），體外轉錄得到的RNA完整性好（如圖5所示）。并且可以在高于37℃條件下進行高效的體外轉錄，有效降低dsRNA含量。
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圖4：Qubit數據顯示，Novoprotein試劑盒20μl轉錄體系產物磁珠純化后產量在100-150 μg。
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圖5：Qsep1結果顯示，體外轉錄得到的RNA完整性良好。
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針對耐熱轉錄體系，近岸蛋白做了不同溫度下轉錄產量及dsRNA含量的測試。
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圖6：采用未修飾dsRNA標準品進行DotBlot實驗及不同轉錄溫度下dsRNA含量測定
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如圖6顯示，轉錄溫度越低，dsRNA含量越高，當轉錄溫度達到50℃時，幾乎檢測不到dsRNA。
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在考慮dsRNA含量的同時，RNA產量同樣也是關鍵指標，近岸蛋白對在不同轉錄溫度下的RNA產量做了測定。
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如圖7所示，針對4kb長度片段，轉錄溫度提高后，產量沒有很大的影響， 20ul轉錄體系依然可以做到130ug以上的產量。
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mRNA藥物研究發展得如火如荼，探索不同的技術路徑和反應體系以解決當前面臨的轉錄純度、加帽率等問題成為研究者們最為關注的重點之一，隨著整個行業的不斷發展，相信成熟的mRNA技術就在不遠的前方。
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相關產品：
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參考文獻
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[1] Borkotoky Subhomoi,Murali Ayaluru,The highly efficient T7 RNA polymerase: A wonder macromolecule in biological realm.[J] .Int J Biol Macromol, 2018, 118: 49-56.
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蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應用解決方案的高新技術企業，主營業務為靶點及細胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發、生產和銷售，并提供相關技術服務。公司定位為醫療健康與生命科學領域原料與技術解決方案的上游供應商，致力于為下游客戶提供及時、穩定、優質的產品及服務，助力全球生物醫藥企業和研究機構的技術與產品創新升級。
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