類器官是能夠在體外三維培養，并表現出相應器官生物學特征的“最小系統”。雖然許多類器官的培養方案日漸成熟，但在實際操作中總會碰到這樣那樣的問題，今天小編整理了一些類器官培養操作中常遇到的問題，希望能夠對各位小伙伴有所幫助。

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Q1: 按照文獻方法進行類器官培養，為什么觀察到的形態卻和文獻不一致？

A1:決定類器官形態的因素有很多，樣本來源是否相同、選用的細胞因子品質是否有差異都有可能改變最終的類器官形態。這里舉一個文獻中的例子，分別取四個高級別漿液性（HGS）卵巢癌患者的腫瘤組織，用同樣的條件進行類器官培養，H&E染色結果顯示它們的形態千差萬別^【1】。因此對于類器官的鑒定，我們不能局限于形態觀察，需要使用多種方法相結合。

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圖1. 由4例HGS卵巢癌患者的腫瘤組織所制備的類器官形態不同^【1】

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Q2：類器官的藥敏實驗中需要使用DMSO作為藥物的溶劑，需要控制DMSO的用量嗎？

A2：考慮到DMSO這類有機物的細胞毒性，建議終濃度不超過0.1%（v/v）。

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Q3：培養過程中發現類器官培養物中有黑色小顆粒，這個是雜質嗎？應該怎樣去除？

A3：黑色小顆粒大概率是雜質或細胞碎片，去除它們有以下兩種方式可以參考：

1、將類器官消化下來，用培養基進行反復清洗，達到稀釋雜質的作用；

2、用無菌手術刀將類器官切成兩半，取1ml注射器吸滿培養基并輕輕推出，沖洗類器官中的雜質^【2】。

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Q4：對于腫瘤患者的個性化醫療測試，PDO、PDX、PDXO的模型可以相互結合使用嗎？

A4：PDO、PDX、PDXO模型有各自的優勢，通常有以下兩種結合方式：PDO-PDX和PDX-PDXO。

1、PDO-PDX是性價比更高的方式，即：先利用PDO進行高通量的藥物篩選，篩選出有效的藥物再進行PDX測試。

2、PDX-PDXO是更精準的藥物測試方式，即：先利用PDX產生大量的體內腫瘤，然后將這些腫瘤分離進行PDXO培養，此時可以通過PDX模型，將PDXO的藥敏實驗結果與體內用藥結果一一對應，進而預測人體用藥的結果，實現對患者更精準的用藥指導；并且可以用PDX模型將轉移后的腫瘤分離，同樣進行PDXO培養和用藥，能夠更精確地對轉移灶進行藥物篩選。

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Q5：類器官怎么從基質膠中回收？

A5：1、將類器官放置在冰上，待基質膠融化后離心進行回收，這種方式適用于不需要將類器官結構完全打散的情況；

2、市售的細胞回收液，可以溫和有效地獲得細胞懸液，不會損傷細胞或細胞表面蛋白。

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Q6：為什么用基質膠來培養類器官？可以用其它類型的凝膠替代嗎？

A6：基質膠能夠為類器官提供支撐作用，目前類器官培養用的基質膠來源于小鼠肉瘤的基底膜基質，其中含有約60%層粘連蛋白、30% IV 膠原和8%的巢蛋白，還含有基底膜聚糖、TGF-?、表皮生長因子、類胰島素生長因子、組織纖溶酶原等1800多種獨特的蛋白質。由于基質膠中各因子的不確定性，并且存在批次間差異，因此目前也有一些聚焦于基質膠替代方案的研究，如圖2^【3】。

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圖2.基質膠的三種替代方案^【3】。（a）去細胞外基質和其他衍生蛋白質，（b）合成水凝膠，以及（c）工程重組蛋白凝膠

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Q7：怎樣確定某一種類器官的培養方式更適用于基質膠包埋法還是氣-液交互法呢？

A7：1、根據所模擬的器官自身生長情況選擇，例如：皮膚的正常生長是有一面需要接觸空氣，那么對于皮膚類器官的培養傾向于利用氣-液交互法來培養^【4】；

2、考慮所培養的類器官模型的應用方向，例如：氣-液交互法培養易于進行病毒感染實驗，因此用于病毒感染實驗的氣道類器官會優先選擇氣-液交互法培養^【5】。

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Q8：在進行藥敏實驗前，類器官的接種方式是怎樣的呢？

A8：藥物篩選前，通常將類器官吹散后，用含2%-5%基質膠的培養基懸浮，并最終鋪在基質膠包被的孔板中^【6-7】。

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Q9：在離心回收時，會有很多類器官粘附在離心管壁，有沒有更好的辦法提高回收率？

A9：建議采用水平轉子代替角轉子，可以有效減少類器官掛在離心管壁的情況。

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Q10：利用腫瘤類器官模型進行篩選的藥物有什么局限性嗎？

A10：1、抗體藥物因為需要免疫細胞的參與，因此腫瘤類器官不能篩選抗體類藥物，此類藥物篩選需要構建腫瘤類器官-腫瘤微環境的模型來實現；

2、由于腫瘤類器官中沒有對血管進行培養，因此抗血管類的藥物也同樣不能進行篩選。

以上就是小編總結的類器官應用相關的10個問題，各位小伙伴還遇到過其它的問題嗎？歡迎大家在留言區提問，小編會一一回答您們的問題哦！此外，歡迎各位掃碼添加近岸小助手二維碼，加入類器官培養交流群，在這里會有專業的技術支持人員幫您解惑答疑，也將定期分享類器官前沿進展，讓類器官培養更簡單！

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參考文獻

【1】Kopper, O. et al. (2019). An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity. Nature medicine, 25(5), 838-849.

【2】MILLER, Alyssa J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature protocols, 2019, 14.2: 518-540.

【3】Kozlowski, M. T. et al. (2021). Towards organoid culture without Matrigel. Communications biology, 4(1), 1-15.

【4】Gangatirkar, P. et al. (2007). Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nature protocols, 2(1), 178-186.

【5】Mulay, A. et al. (2021). SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. Cell reports, 35(5), 109055.

【6】Van de Wetering, M. et al. (2015). Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell, 161(4), 933-945.

【7】Hirt, C. K. et al. (2022). Drug screening and genome editing in human pancreatic cancer organoids identifies drug-gene interactions and candidates for off-label therapy. Cell genomics, 2(2), 100095.