Cell Metab. (IF=30.9)｜上海交大劉軍力研究員團隊：DLAT抑制亮氨酸分解驅動腫瘤發生

英文標題：Pyruvate metabolism enzyme DLAT promotes tumorigenesis by suppressing leucine catabolism

中文標題：丙酮酸代謝酶DLAT通過抑制亮氨酸分解代謝促進腫瘤發生

發表期刊：Cell Metabolism

影響因子：30.9

研究背景

肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)在全球范圍內的發病率和死亡率呈顯著上升趨勢，代謝重編程在其進展過程中扮演著關鍵角色，主要體現為Warburg效應以及支鏈氨基酸(BCAA)代謝的異常改變。丙酮酸作為Warburg效應的重要中間產物，其代謝與腫瘤發生密切相關，而丙酮酸脫氫酶(PDH)復合體是連接糖酵解與三羧酸循環（TCA循環）的關鍵橋梁，其中二氫硫辛酰胺S-乙酰轉移酶(DLAT)作為PDH復合體的核心組分，不僅在丙酮酸代謝中通過乙酰基轉移參與乙酰輔酶A的生成，還被發現可作為蛋白質乙酰轉移酶修飾其他分子，但它在協調其他代謝通路促進腫瘤生長方面的作用尚未明確。

在支鏈氨基酸代謝中，亮氨酸是激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1(mTORC1)通路的關鍵調控因子，它能增強Rag GTPases與Raptor的結合，從而激活mTORC1，維持蛋白質合成信號，推動癌細胞快速生長，且肝癌組織中亮氨酸水平升高與HCC進展顯著相關。AU RNA結合甲基戊二酰輔酶A水合酶(AUH)是亮氨酸分解代謝中的關鍵酶，負責催化生成S-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)，但其代謝活性的調控機制及其在腫瘤進展中的具體作用仍有待深入探究。

鑒于此，本研究旨在探究DLAT是否通過調控亮氨酸代謝參與HCC的發生發展，以期揭示HCC進展的新機制并為其治療提供新靶點。

技術路線

研究結果

1、肝細胞癌中DLAT的高表達與不良預后相關

研究者發現丙酮酸代謝中的DLAT與HCC有著緊密的關聯：①DLAT在HCC中顯著高表達（圖1B-D），且其高表達與患者總生存期縮短、疾病特異性生存期和無進展間隔降低密切相關。此外，DLAT也是HCC的獨立風險因素；②DLAT在惡性細胞中顯著高表達，且其表達水平與惡性細胞比例呈顯著正相關（圖1E-G）；③HCC樣本中DLAT表達升高（圖1I-L）；同樣地，DEN誘導模型中也發現DLAT的高表達（圖1M-N）；④DLAT亦可作為HCC的潛在診斷生物標志物。綜上，DLAT不僅在HCC進展中發揮關鍵作用，其表達水平還可作為預后評估和早期診斷的潛在靶點。

圖1. 肝細胞癌中DLAT高表達與不良預后相關

2、靶向DLAT可抑制體外和體內的腫瘤增殖

基于上述結果，研究者推導并驗證了DLAT的表達與癌細胞增殖密切相關：

體外實驗：DLAT沉默會導致Huh7和HepG2細胞增殖受到顯著抑制（圖2A-C）。在構建的DLAT敲除穩定細胞系中，HepG2-sgDLAT細胞的生長速率顯著低于對照組，CCK8分析結果也與此一致（圖2C）。

皮下異種移植模型：為驗證DLAT對肝癌進展的作用，采用皮下異種移植模型。結果顯示，sgDLAT組腫瘤生長速率、體積和重量顯著低于對照組（圖2D-F），且不影響小鼠體重。后續實驗進一步確認 MHCC-97H-sgDLAT腫瘤中DLAT被高效敲除（圖2G-H）；Ki-67染色結果也表明，DLAT缺失會抑制HCC增殖（圖2H-I）。

AAV-DIO-shDLAT和MYC/Trp53?/?肝癌模型：為深入研究DLAT在肝癌發展中的關鍵作用，研究者構建了AAV-DIO-shDLAT和MYC/Trp53?/?肝癌模型（圖 2J）。結果顯示，AAV-DIO-shDLAT組在 MYC/Trp53?/?注射21天后，腫瘤可見性顯著降低（圖2K）；30天后，肝臟腫瘤數量和最大腫瘤體積均顯著減少（圖2L-N），且肝臟重量無顯著變化，同時證實DLAT被高效沉默（圖2O-Q）。此外，在HCC樣本中，AAV-DIO-shDLAT組的Ki-67表達顯著降低（圖2P-R）。

其他模型驗證：在DEN/CCl?模型和DEN誘導模型中，也觀察到類似結果，即DLAT敲低顯著減少腫瘤進展和Ki-67表達。

綜上，DLAT在體外和體內均是肝癌增殖和進展的關鍵驅動因子。

圖2. 靶向DLAT可抑制體外和體內的腫瘤增殖

3、DLAT缺失對TCA循環中間產物影響有限，且通過促進亮氨酸分解代謝調控HCC進展

（1）DLAT缺失對TCA循環的影響及補償機制

對Huh7-sgDLAT細胞及對照細胞的代謝組學分析顯示，DLAT缺失僅使細胞內琥珀酸總量下降，對檸檬酸、順烏頭酸等其他TCA循環中間產物無顯著影響（圖3A）。代謝通量分析證實，DLAT缺失會降低丙酮酸來源的乙酰輔酶A及TCA中間產物水平，但谷氨酰胺可通過分解代謝補償這一影響——DLAT缺失顯著增加谷氨酰胺來源的α-酮戊二酸、順烏頭酸等TCA中間產物，維持循環穩定性。

（2）靶向DLAT促進亮氨酸分解代謝及其核心作用

代謝組學深度分析發現，Huh7-sgDLAT細胞中亮氨酸、天冬氨酸、纈氨酸水平顯著下調（圖3A-B），質譜分析進一步驗證了這一結果（圖3E）。功能實驗顯示，僅補充亮氨酸可逆轉DLAT缺失導致的細胞生長抑制（圖3C-D），且亮氨酸水平與DLAT mRNA表達呈顯著正相關（圖3F）。

機制上，DLAT缺失對BCAA相關氨基酸轉運體的表達及功能無顯著影響（圖3G-H），但代謝通量分析表明其可促進亮氨酸分解代謝——sgDLAT組中源自亮氨酸的HMG-CoA和乙酰輔酶A水平升高，而上游代謝物KIC比例不變，提示DLAT不參與亮氨酸轉氨反應（圖3I-L）。此外，BCAA分解代謝上調與HCC患者更長的總生存期和無病間期相關（圖3M-N），證實亮氨酸分解代謝在DLAT介導的HCC進展中起核心作用。

綜上，DLAT缺失對TCA循環的直接影響有限，主要通過調控亮氨酸分解代謝影響HCC進展。

圖3. 靶向DLAT可促進肝細胞癌中的亮氨酸分解代謝

4、DLAT缺失通過抑制亮氨酸-mTOR信號通路抑制肝細胞癌增殖

為闡明DLAT調控HCC發展的分子與代謝機制，結合RNA-seq與GSEA分析，發現mTOR信號通路在DLAT高表達組顯著富集（圖4A-D），且DLAT表達與mTOR信號呈正相關。同時，DLAT缺失也顯著抑制mTOR、S6K和S6的磷酸化（圖4E-F），表明mTOR信號被阻斷。此外，亮氨酸補充能夠逆轉DLAT缺失導致的mTORC1抑制（圖4G），且恢復Rag GTP酶與Raptor的相互作用（圖4H），證實DLAT通過亮氨酸調控mTOR信號。另一方面，隨著亮氨酸補充，DLAT缺失對HCC細胞增殖的抑制也顯著減弱（圖4I-J）。同樣地，氨基酸信號通路（調控mTOR激活）亦與HCC患者不良預后相關（圖4K-L），這些結果都指向著mTOR信號異常與HCC進展密切相關。綜上，DLAT缺失通過降低亮氨酸水平抑制mTOR信號，從而抑制HCC的增殖與進展。

圖4. DLAT缺失通過抑制亮氨酸-mTOR信號通路抑制肝細胞癌增殖

5、DLAT作為亮氨酸分解代謝酶AUH的乙酰轉移酶發揮作用

為闡明背后潛在的分子機制，研究者先是發現了DLAT的缺失對關鍵亮氨酸分解代謝酶的蛋白水平影響較小，隨后推測出可能是翻譯后的修飾調控所致，即DLAT可能通過調控這些分解代謝酶的乙酰化水平來影響亮氨酸代謝。綜合乙?；M深度分析（圖5A-B）和KEGG富集（圖5C）的結果， DLAT很有可能調控亮氨酸分解代謝酶的乙酰化。

由于亮氨酸代謝酶多定位于線粒體，研究者便在全局線粒體乙酰化水平分析中，發現DLAT的缺失顯著降低了部分蛋白的乙?；剑S后鑒定出47個與DLAT互作的蛋白（圖5D）。結合乙酰化組學結果以及BCAA代謝相關酶數據集，三者交集的AUH，一種亮氨酸分解代謝酶，被確定為DLAT的潛在乙?；悬c（圖5D）。

后經驗證，DLAT的過表達確實顯著增強了AUH乙?；▓D5E），而DLAT敲除則相反（圖5F）；體外乙酰化實驗亦證實DLAT直接乙?；疉UH（圖5G）。聯合酶學特性分析，DLAT對AUH的Km值為0.6753 mM（圖5H），表明高底物親和力；反應動力學顯示負協同效應（Hill系數≈0.7462）和濃度依賴性（圖5I）。

此外，DLAT與AUH在線粒體中共定位（圖5J）；免疫印跡及coIP的結果都確認兩者的直接互作關系（圖5K-M）；而當C端內域(DI)缺失時互作會被破壞，表明C端區域對互作至關重要。

綜上，DLAT直接與AUH互作并調控其乙?；?。

圖5. DLAT作為亮氨酸分解代謝酶AUH的乙酰轉移酶發揮作用

6、DLAT介導的AUH在K109位點的乙?；龠M肝細胞癌進展

在Huh7-sgDLAT細胞中，其生長速率顯著低于對照組（圖6A），而此卻能夠通過AUH敲低逆轉其細胞生長抑制（圖6A）。而在EdU染色實驗中，亦觀察到類似結果，即AUH敲低緩解了DLAT缺失對HCC細胞增殖的抑制作用（圖6B-C）。此外，AUH敲低也減弱DLAT缺失后亮氨酸水平的下降（圖6D），表明DLAT依賴AUH調控亮氨酸代謝。

為探索背后調控機制，結合乙?；M學數據（圖 5A），鑒定出AUH的三個潛在乙?；稽c：K109、K160和K211（圖6E）。而其中的K109被成功驗證，其應是此調控網絡中關鍵位點（圖6E-G），同時此位點在物種間高度保守（圖6H）。

將K109位點突變，命名為AUHK109R，在酶活性驗證中，能夠發現突變體的催化活性顯著高于野生型，證實K109乙?；种艫UH功能（圖6I）。此外，AUHK109R過表達還會抑制mTOR的激活（圖6J），EdU染色也顯示其增殖抑制（圖6K-L）。

綜上， DLAT直接乙酰化AUH的K109位點，抑制其催化活性，從而促進HCC增殖。

圖6. DLAT通過K109位點乙?；种艫UH活性

7、脂質納米顆粒包裝的AUH突變體mRNA有效抑制體內腫瘤異種移植物的生長

基于上述研究，研究者構建了脂質納米顆粒(LNP)封裝的AUHK109R突變體mRNA作為新的治療方案。結果顯示，此方案能夠顯著抑制MHCC-97H異種移植瘤的生長 ，其腫瘤體積（圖7A-B）和重量（圖7C-D）均顯著降低，且各組小鼠體重無顯著差異，同時對腫瘤增殖和干細胞特性也表現出抑制作用（圖7E-G）。

檢測皮下移植瘤中的亮氨酸水平，發現顆粒治療組中的亮氨酸水平顯著降低（圖7H），推測AUH功能異?？赡芘c亮氨酸代謝紊亂相關。另外，該組中mTOR激活被顯著抑制（圖7I）。

在治療作用方面，與對照組相比，治療組的腫瘤體積和重量顯著降低（圖7K），Ki-67和EpCAM表達水平（圖7L-N）和mTOR磷酸化水平也都顯著下降（圖7O），但三組小鼠體重無顯著差異。在安全性評估方面，該方案在BALB/c裸鼠中，對正常組織無明顯毒性。

綜上所述，該方案能夠顯著抑制HCC腫瘤的生長，且在體內具有良好的安全性，為HCC治療提供了新的策略。

圖7. 脂質納米顆粒包裝的AUH突變體mRNA有效抑制體內腫瘤異種移植物的生長

研究結論

本研究聚焦丙酮酸代謝酶DLAT在HCC中的作用及機制，發現DLAT在HCC中高表達且與患者不良預后密切相關。其通過直接乙酰化亮氨酸分解代謝酶AUH的K109位點，抑制AUH活性，導致亮氨酸積累并持續激活mTORC1信號通路，從而促進腫瘤增殖?；诖?，研究團隊開發的AUHK109R-mRNA脂質納米粒(LNP)治療策略，可有效恢復亮氨酸分解代謝、抑制mTOR激活，在體內顯著抑制HCC生長且安全性良好，為HCC治療提供了新靶點和潛在治療方案。
 

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Run動 撰文

Winly 校稿