Redox Biology | 國家重點研發計劃首席科學家教授團隊深度解析色氨酸代謝物3-HAA—治療BPD的 “秘密武器”

英文標題：The tryptophan metabolite 3-hydroxyanthranilic acid alleviates hyperoxia-induced bronchopulmonary dysplasia via inhibiting ferroptosis

中文標題：色氨酸代謝產物3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-HAA)通過抑制鐵死亡緩解高氧誘導的支氣管肺發育不良

發表期刊：Redox Biology

影響因子：10.7

客戶單位：重慶醫科大學附屬兒童醫院

百趣提供服務：色氨酸高通量靶標代謝組學、MetPro-Ⅱ代謝物與蛋白相互作用

支氣管肺發育不良(Bronchopulmonary Dysplasia, BPD)是一種常見于早產兒的慢性呼吸系統疾病。隨著極早產兒存活率的提升，支氣管肺發育不良的發病率卻居高不下，這嚴重影響了早產兒的生存率和生活質量。探索BPD的潛在機制有助于開發新的有效治療策略。

有研究表明，色氨酸代謝物吲哚-3-乙酸在慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)中具有調節炎癥、改善肺氣腫和緩解肺功能下降的潛在作用。由于COPD與BPD有一些共同的病理特征，而色氨酸代謝在病理條件下會受到影響，所以色氨酸及其代謝物是非常有吸引力的診斷、預后和治療生物標志物。此外，色氨酸代謝物的生物學效應及其在疾病中的變化表明，它們可能作為潛在的治療靶點。但目前，色氨酸代謝產物在新生兒BPD中的復雜功能和機制仍有待探索。

研究者運用UHPLC-MS/MS代謝組學技術（由上海百趣生物提供支持），對BPD嬰兒和非BPD嬰兒的氣管吸出物(Tracheal Aspirates, TAs)中的色氨酸代謝物含量展開分析（圖1A）。經鑒定，TAs中存在21種代謝物，其中BPD組的3-HAA和ILA相較于對照組呈現降低趨勢（圖1B-C）。

鑒于臨床樣本中這一發現，為進一步探究色氨酸代謝失調是否也存在于實驗環境中，研究者構建了成熟的SD大鼠高氧誘導的BPD模型。與對照組相比，BPD組的肺泡明顯簡化，這表明其肺發育受到了損害（圖1D）。在大鼠實驗中，鑒定出27種代謝物，且肺組織中的代謝物改變更為顯著。其中，BPD組的3-HAA、NAS、5-HTOL較對照組降低（圖1E-F）。綜上所述，無論是在BPD組的TA樣本還是肺組織中，3-HAA均出現減少情況，因此后續圍繞3-HAA展開了進一步深入研究。

研究者通過對大鼠肺組織進行3-HAA的IHC染色（圖 2A），對肺泡II型上皮細胞(AECII)進行3-HAA的IF染色（圖2G），證實了體內和體外高氧模型中3-HAA的減少。為了研究各組間3-HAA水平差異的根本原因，研究者對大鼠肺組織進行了3-HAA代謝相關酶KMO、KYNU和HAAO的WB分析（圖2B-C）和IHC染色（圖2D-F）。結果表明，BPD組KMO和KYNU蛋白表達降低，導致3-HAA產生減少，而HAAO蛋白表達升高導致3-HAA下游代謝增加。此外，AECII的WB分析（圖2H-I）和IF染色（圖2J-L）顯示了類似的模式：高氧組KYNU和KMO降低，HAAO升高。RT-qPCR結果在體內和體外高氧模型中也是一致的，為體內和體外模型中觀察到的差異提供了合理的解釋?？偟膩碚f，BPD與3-HAA降低有關，這部分是由相關代謝酶的失調引起的。

研究者深入探究了補充3-HAA能否緩解高氧誘導的BPD，在為期14天的高氧建模期間，BPD+3-HAA組的大鼠按照特定方案，隔天接受3-HAA霧化處理（圖3A）。結果顯示，3-HAA霧化展現出良好效果，具體表現為顯著改善了組織病理學狀況，使得 MLI（平均線性截距）數值明顯降低（圖3B），這反映出肺泡結構得到優化。同時，3-HAA霧化有效地提升了體內3-HAA的水平（圖3C），為發揮其保護作用提供了物質基礎。尤為關鍵的是，3-HAA對高氧處理后的SPC細胞起到了明顯的保護作用（圖3D），有助于維持AECII的正常功能。在蛋白水平層面，3-HAA顯著降低了MPO和COX2的表達，有力地減輕了炎癥反應，同時增加了SPC的表達，使得AECII損傷得到明顯改善（圖3E）?？傮w而言，3-HAA通過改善肺泡復雜性、抑制炎癥，對高氧誘導的BPD大鼠模型的肺損傷切實發揮了保護作用。

研究者為了探索3-HAA減輕新生大鼠高氧誘導的BPD的潛在機制，通過LiP-SMap方法（MetPro-Ⅱ代謝物與蛋白相互作用，由百趣生物提供）進行了蛋白質組學研究（圖4A）。KEGG通路分析和GO分析富集到一種特定形式的細胞死亡，稱為鐵死亡，這是一種鐵依賴的，脂質過氧化驅動的程序性細胞死亡形式（圖4B-C）。Fe²⁺參與芬頓反應，加劇了脂質過氧化和細胞損傷。富含磷脂的線粒體膜特別容易受到氧化損傷，導致線粒體功能障礙和能量代謝受損。接下來，研究者通過評估鐵死亡相關蛋白和mRNA表達、醛和Fe²⁺來評估鐵死亡。研究結果顯示，高氧誘導的BPD導致肺組織中總醛、亞鐵、MDA和4-HNE含量升高，BPD+3-HAA組顯著降低（圖4D）。此外，經過3-HAA處理后，與BPD組相比，長鏈?；o酶A合成酶4(ACSL4)、轉鐵蛋白(TF)、鐵蛋白重鏈1 (FTH1)、核受體共激活因子4(NCOA4) 和微管相關蛋白輕鏈3B-II(LC3B-II)降低，而谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)升高（圖4E）。利用透射電鏡觀察大鼠肺組織AECII的線粒體改變，揭示了典型的鐵死亡相關變化，如線粒體固縮和嵴丟失，3-HAA治療減弱了這些線粒體異常（圖4F）。綜上所述，3-HAA可抑制高氧誘導的BPD大鼠模型中的鐵死亡，從而減輕肺損傷。

AECII持續損傷與BPD發生發展密切相關，前期體內實驗發現大鼠肺組織AECII存在線粒體鐵死亡樣變化。研究用CCK-8確定3-HAA、鐵死亡誘導劑erastin和抑制劑DFO的最佳濃度，確定最佳濃度后開展體外實驗。結果表明，3-HAA和DFO減弱高氧誘導的細胞轉化，erastin則逆轉3-HAA的作用。在高氧誘導的AECII細胞模型中，用熒光探針DCFH-DA檢測的活性氧(ROS)水平（圖5A）以及用Liperfluo熒光檢測的脂質過氧化程度（圖5B），與對照組（C組）相比均顯著升高。補充3-HAA和DFO可減少過量的ROS和脂質過氧化產物的生成，而Erastin可逆轉這一作用。此外，氧化還原和鐵死亡相關指標的含量變化也呈現相似趨勢。例如，Fe²?、總醛、MDA和H?O?，在高氧組（H組）和高氧+3-HAA+Erastin組（HAE組）中升高，經3-HAA和DFO處理后則降低。同樣地，谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)水平在H組和HAE組中降低，在高氧+3-HAA組（HA組）和高氧+3-HAA+DFO組（HAD組）中升高（圖5C-E）。與H組相比，AECII中FTH1、NCOA4、COX2和LC3B-II的蛋白質水平在3-HAA和DFO處理后也降低，而GPX4表達升高（圖5F）。然而，3-HAA的抗鐵死亡作用被Erastin逆轉。由于暴露于高氧環境，AECII細胞出現線粒體收縮和線粒體膜密度增加的現象。3-HAA和DFO處理減輕了線粒體的改變，因為它們在預防鐵死亡中起著關鍵作用。相比之下，Erastin激活了鐵死亡，并阻斷了3-HAA的保護作用（圖5G）。綜上所述，這些研究結果表明，3-HAA減輕了高氧誘導的AECII鐵死亡。

研究者運用LiP-SMap方法探尋3-HAA的作用機制，發現FTH1極有可能是3-HAA的結合對象（圖6A） 。為進一步明確二者關聯，采用表面等離子共振技術，深入剖析它們之間的結合動力學與分子親和力。實驗數據清晰顯示，3-HAA對FTH1的親和力呈現出顯著的劑量依賴特性（圖6B），這表明二者結合緊密。為直觀展示FTH1與3-HAA的相互作用方式，研究者借助分子對接技術，精準揭示了二者結合模式（圖6C）。結果表明，3-HAA巧妙地通過氫鍵與 FTH1上的SER31和SER59殘基相連。鑒于 NCOA4與FTH1的相互作用在鐵蛋白自噬進程中至關重要，研究者再次運用SPR技術，探究3-HAA是否通過干擾NCOA4-FTH1相互作用，來影響鐵蛋白自噬。實驗結果顯示，重組的FTH1能夠以高親和力與重組NCoA4蛋白特異性結合（圖6D） 。然而，當體系中引入3-HAA后，FTH1-NCOA4的結合進程被有效阻斷（圖6E）。為進一步驗證該結果，研究者開展了免疫共沉淀實驗。結果顯示，相較于高氧組AECII，經3-HAA處理后的細胞中，NCOA4與FTH1之間的相互作用明顯減弱，在抗NCOA4抗體拉下的免疫沉淀產物中，FTH1的含量顯著減少（圖6F）。綜上，外源性補充3-HAA能夠直接靶向FTH1，通過破壞NCOA4-FTH1相互作用，有效緩解鐵死亡進程，進而在體內體外實驗中，顯著抑制高氧誘導的AECII損傷，為BPD的治療提供了全新的理論依據與潛在靶點。

BPD是需要呼吸支持的早產兒中最常見的慢性肺部疾病。由于缺乏有效的預防和治療策略，BPD嬰兒的死亡率高于非BPD早產兒，預后較差，給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。了解BPD的潛在發病機制對于制定有針對性的干預措施至關重要。最近的研究強調了代謝功能障礙在高氧引起的肺損傷中的作用。在本研究中，作者旨在探討色氨酸代謝物在預防高氧誘導的BPD中的潛在作用，并探討其可能的機制。

本研究首次揭示了BPD與3-HAA水平顯著降低相關，表明色氨酸代謝途徑失調。補充3-HAA通過靶標FTH1抑制鐵死亡途徑，從而減輕大鼠和AECII的高氧誘導損傷。本研究強調了靶標3-HAA和鐵死亡的臨床應用潛力，并為BPD的管理和治療提供了新的視角。