過繼性細胞免疫治療（ACT）在血液瘤治療中成效顯著，但面對實體瘤時效果有限，需創新策略。利用iPSC和基因編輯技術，新型iTNK細胞結合了T細胞和NK細胞的優勢，展現出對晚期實體瘤的潛在療效且具有安全性。然而，iTNK細胞數量稀少，限制了其臨床應用。近日，北京大學鄧宏魁團隊在Cell Reports Methods上發表了題為“Generation of dual-attribute iTNK cells from hPSCs for cancer immunotherapy”的高水平論文。該研究首次公開了由hPSC誘導生成雙屬性T-NK（iTNK）細胞的方法，并驗證該種細胞對多種腫瘤細胞譜系均有顯著抑制生長作用，解決了大規模生產臨床級的雙屬性細胞的技術限制，為免疫細胞廣泛應用于癌癥治療提供了新策略。
小編整理了該論文中hPSC誘導生成iTNK細胞的Protocol，供廣大科研工作者參考。
圖1 hPSC誘導生成雙屬性T-NK（iTNK）流程簡圖[1]
hPSC誘導生成iTNK細胞各階段培養基試劑配方
表1 hPSC誘導生成雙屬性T-NK（iTNK）細胞分化培養基組分
此表格根據文章內容繪制
由hPSC分化為HPC
在3D培養分化系統中，hPSC先在mTesR Plus培養基中培養，分化前一天，將每孔2×105個細胞接種在6孔超低吸附板中。
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分化第0天，將培養基更換為含有20 ng/mL BMP4、20 ng/mL bFGF的RPMI1640完全培養基（詳細組分詳情見表1）。
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分化第 2 天和第 4 天，將培養基更換為含有 5 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF的RPMI1640完全培養基中（詳細組分詳情見表1）。
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分化第6天和第8天，將培養基更換為含有 10 ng/mL VEGF、20 ng/mL SCF、20 ng/mL FLT3L、20 ng/mL TPO、5 ng/mL IL-7的IMDM完全培養基中（詳細組分詳情見表1）。
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在分化第10天，用Accutase解離細胞團，制備單細胞懸液，分選出CD34+ HPC細胞。
HPC-ATO-T細胞分化系統
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在胸腺中產生T細胞的過程極為復雜，目前，人工胸腺類器官（artificial thymic organoid, ATO) T細胞分化系統是體外產生成熟T細胞最有效的方法。取hPSC分化得到的1×104個HPC與1×105個MS5-hDLL4飼養層細胞重懸于6 mL含有5 ng/mL FLT3L、5 ng/mL IL-7的 IMDM 培養基中，混勻（詳細組分詳情見表1）；然后，將上述混合細胞懸液接種于Transwell上分化培養 8 周。
誘導T細胞生成iTNK
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收獲 ATO 衍生的細胞，機械吹打消化成細胞懸液，2000 rpm離心 3 分鐘，重懸于10% FBS、50 ng/mL IL-2、10 ng/mL IL-7、5 ng/mL IL-15、10 ng/mL IL-21、anti-CD3/CD28/CD2 T 細胞激活劑（25 uL/mL）的T 細胞擴增完全培養基（詳細組分詳情見表1）。
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將以上細胞懸液接種于24 孔透明平底超低吸附板中培養2 天后，于T細胞擴增完全培養基（不含anti-CD3/CD28/CD2 T細胞激活劑，詳細組分詳情見表1）培養4周，得到iTNK細胞。
總之，hPSC來源的iTNK為癌癥免疫治療提供了新的方向，該項研究為iTNK在癌癥臨床試驗的應用建立起了穩健的細胞獲取方法，為大規模獲得臨床級iTNK鋪平了道路，是創新腫瘤免疫療法中的重要參考。