目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域。在整個qPCR技術中，引物設計是非常重要的一環，它決定了擴增效率是否達標、擴增產物是否特異，最終決定我們的實驗結果的好壞。而引物設計往往令很多科研工作者感到煩惱，無論是自己設計還是外包設計，總是擔心引物效果不好，今天就給大家講解一下引物設計的原理流程和特異性驗證方法。

當我們在引物設計時，首先需要遵循許多原則。這些原則可以用來指導引物設計或者初步判斷設計引物的好壞。

引物設計原則

1. 引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性，模板鏈和擴增單鏈產物不能形成二級結構。

2. 引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，即Taq酶的最適溫度。

3. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的堿基一般不用A（3’端堿基序列最好是G、C、CG、GC），因為A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高。另外引物間3’端的互補、二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR 影響不大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

4. 引物的GC含量一般為40-60%，以45-55%為宜，過高或過低都不利于引發反應。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。如果G-C比例超出，則在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例過高，則同樣在5’端增加Gs或Cs。

5. 引物所對應模板序列的Tm值最好在72℃左右。（Tm值曲線以選取72℃附近為佳，5’端到3’端的下降形狀也有利于引物引發聚合反應），至少要在55-80℃之間。

6. 堿基要隨機分布，引物自身不能有連續4個堿基的互補。引物之間不能有連續4個堿基的互補。

7. 引物 3′ 端不要終止于密碼子的第3位（密碼子的第三位易發生簡并）。

引物設計第一步：分析目的基因

在設計引物之前，我們需要對目的基因進行分析，我們需要明確目的基因的序列，以及序列信息，包括基因的內含子和外顯子分布，以及不同的轉錄本有哪些，有沒有信號肽序列等等。現在有很多引物設計網站和軟件可以幫助大家進行引物設計，根據網站或者軟件給出的各個備選引物，再結合上面的規則以及引物信息，就可以篩選出實驗所需要的最佳引物。

接下來，我們以人的Bcl-2（B淋巴細胞瘤-2基因）基因為例，設計一對可以同時擴增其不同剪切變體的qPCR引物。首先，通過NCBI查詢Bcl-2的基因結構，這里要注意對比基因名稱、種屬，確保都要一致。

Bcl-2有2個不同的轉錄本，一共有3個外顯子區域，其中第1個和第2個外顯子區域是共有的。

我們的目的是將不同的轉錄本都擴增出來，所以需要找到這些轉錄本的同源序列?？梢钥吹?，這個基因有多個不同的轉錄本，第一個轉錄本的第1、2個外顯子區域是所有轉錄本的同源序列（紅框內的綠色小豎線）。只需要將引物設在第1、2個外顯子之間就可以滿足實驗需求。

在基因信息的頁面下拉，就能看到該基因對應的mRNA和Protein信息，找到mRNA的序列號， 點擊即可進入GenBank了。

點擊第一個mRNA亞型的ID后，可以看到該亞型的詳細信息，下拉后可以看到外顯子信息，exon1的位置是1-596 bp，exon2的位置是597-1467 bp。（點擊Highlight Sequence Features后，瀏覽器的下方就會出現選項，選擇查看exon，這樣也可以快速定位外顯子的位置。）

確定位置后，向上拉網頁，在右側點擊Pick Primers，就能直接進入Primer-Blast的頁面進行引物設計了。

引物設計的第二步：生成引物

我們已經查到第1，2個外顯子的位置是1-596和597-1467，在這兩個區間設計引物，才能保證把所有的轉錄本都擴增出來。另外需要注意，qPCR的產物大小一般不超過300 bp，并且退火溫度設置在57℃-63℃的范圍內最佳，跨內含子的設計有助于辨別基因組DNA的污染，提高PCR產物的特異性。設置好這些參數后，點擊Get Primers即可生成引物。

這時，NCBI就會彈出來告訴你，這樣的參數選擇會擴增到其他剪切變體，我們勾選不同的剪切變體并提交，就可以獲得合適的引物對。

接下來網站給出了6對不同的PCR引物，理論上每一對都可以滿足PCR的需求，實際操作時，大家還需要根據網站或軟件對引物信息進行分析和篩選，才能最終確定合適的引物。

引物設計的第三步：引物特異性驗證

其實，Primer-Blast除了可以設計引物外，還可以對我們自己設計的引物進行評估。返回引物設計的頁面，輸入我們設計好的上下游引物，其它參數可以不調整，提交后就可以看到這對引物是否在其它基因上也存在，如果全部都顯示在我們想要擴增的基因中，則說明該引物特異性較強。例如引物 Primer pair 1的分析結果顯示，該引物對可以同時擴增alpha和beta這2個轉錄本。

除了Primer-Blast以外還有很多其他的引物設計網站，例如Primer Bank（https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank）。打開Primer Bank的網站，在 Search by 的選項處下拉選擇 GenBank Accession，Species 的選項處下拉選擇Human，將mRNA的ID放在 For text 里面，然后點 Submit。

根據網站反饋的引物分析結果，在 Gene Description 那里再對一下基因信息，確定是自己想找的基因后，對生成的引物序列進行分析篩選后選擇最佳引物用于后續實驗。除了以上網站以外，常用的引物設計網站還有Primer3 Plus (http://www.primer3plus.com/),感興趣的同學可以自行查詢使用方法。

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