1. 取 100ul 全血，按照細胞表面抗原染色方法標記 CD4 和 CD25。根據說明書和抗體管上的標識確定抗體用量。按個人要求設置空白管、對照管、補償管和樣本管。4 ℃孵育 30分鐘。
2. 用去離子水（不能用 PBS）將溶血素稀釋成 1×。每管用量為 2ml。
3. 染色完的全血不用洗，加 2ml 稀釋好的溶血素，迅速混勻，靜置 8~10 分鐘，觀察溶液透亮后用預冷 PBS 溶液洗滌細胞，300 -400 g 離心 5 分鐘，去上清。
4. 用 3 倍體積的固定/破膜稀釋液（#ICD01） 稀釋 固定/破膜濃縮液（#ICC01），制成固定/破膜工作液，注意要新鮮配制，每管的用量為 1ml。
5. 旋渦震蕩重懸細胞后加入 1ml 的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3 稀釋好），并再次旋渦混勻。
6. 避光 4℃孵育 30 分鐘到 60 分鐘。
7. 將破膜緩沖液（#ICB01）用去離子水 1:9 稀釋，制成工作液。每管的用量為 8.5ml。
8. 無需洗滌，直接加入 2ml 破膜緩沖液工作液（Permeabilization Buffer）300 -400 g 離心洗滌細胞并棄去上清液。
9.（可選）重復第 9 步操作洗滌細胞。
10. 加入 100 ul PBS 重懸細胞。
11. 加入大鼠血清 2 ul，室溫避光孵育 30 分鐘。
12. 加入適量的 Foxp3 抗體，對照管中加入適量的同型對照，具體用量參照說明書，避光 4℃孵育至少 30 分鐘。
13. 加入 2ml 破膜工作液離心洗滌細胞并棄去上清液。
14. 重復上一步洗滌細胞。
15. 用適量體積的 Flow Cytometry Staining Buffer 重懸細胞，并上機檢測并分析。注：由于染色過程中使用了細胞固定和破膜，對比起活細胞在形態上會有一定變化，因此FSC/SSC 圖中圈門時需要做一定調整。
注：以上說明書僅供參考，具體實驗請對照廠商說明書操作。