1. 制備 PBMC，并調(diào)整細(xì)胞濃度至 10^7/ml。
2. 在每個(gè)流式上樣管中加入 100 μl 準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約為 1×10^6 個(gè)。
3. 按照細(xì)胞表面抗原染色方法標(biāo)記 CD4 和 CD25。根據(jù)說(shuō)明書(shū)和抗體管上的標(biāo)識(shí)確定抗體用量（一般來(lái)說(shuō)是 20ul，可能隨批次有差異）。按個(gè)人要求設(shè)置空白管、對(duì)照管、補(bǔ)償管和樣本管。4℃ 孵育 30 分鐘。
4. 用預(yù)冷 PBS 溶液洗滌細(xì)胞，300-400 g 離心 5 分鐘，去上清。
5. 用 3 倍體積的固定/破膜稀釋液 稀釋 固定/破膜濃縮液，制成固定/破膜工作液，注意要新鮮配制，每個(gè)樣本的用量為 1ml。
6. 旋渦震蕩重懸細(xì)胞后加入 1ml 的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3 稀釋好），并再次旋渦混勻。
7. 避光 4℃ 孵育 30 分鐘到 60 分鐘。
8. 將破膜緩沖液用去離子水 1:9 稀釋，制成工作液。每個(gè)樣本的用量為 8.5ml。
9. 無(wú)需洗滌，直接加入 2ml 破膜緩沖液工作液（Permeabilization Buffer）300-400 g 離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。
10.（可選）重復(fù)第 9 步操作洗滌細(xì)胞。
11. 加入 100 ul PBS 重懸細(xì)胞。
12.（封閉可選）體系中加入 2%的大鼠血清 2 ul，室溫避光孵育 30 分鐘。
13. 體系加入適量的 Foxp3 抗體，對(duì)照管中加入適量的同型對(duì)照，具體用量參照說(shuō)明書(shū)，避光 4℃孵育至少 30 分鐘。建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出抗體的最適濃度。
14. 加入 2ml 破膜緩沖液工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。
15. 重復(fù)上一步洗滌細(xì)胞。
16. 用適量體積的 Flow Cytometry Staining Buffer 重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測(cè)并分析。注：由于染色過(guò)程中使用了細(xì)胞固定和破膜，對(duì)比起活細(xì)胞在形態(tài)上會(huì)有一定變化（一般是變小），因此 FSC/SSC 圖中圈門時(shí)需要做一定調(diào)整。
注：以上說(shuō)明書(shū)僅供參考，具體實(shí)驗(yàn)請(qǐng)對(duì)照附件廠商說(shuō)明書(shū)操作。