NK細胞作為先天免疫系統的關鍵組成部分，在臨床腫瘤治療上發揮著關鍵作用。但傳統NK細胞療法面臨供體異質性、擴增效率低、體內持久性差等挑戰。與其他來源NK細胞相比，iPSC-NK細胞通過重編程技術可實現持久擴增、基因編輯和標準化生產，成為"現貨型"細胞療法的理想載體，是近幾年腫瘤免疫療法的研究熱點[1]。
iPSC-NK全球臨床進展
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目前，全球iPSC衍生出的NK細胞療法管線相對較少，主要包括iNK和CAR-iNK兩大類型，相關研究仍處于臨床前或早期臨床階段。進展最快的是Fate Therapeutics（FT522、FT576）和Century Therapeutics（CNTY-101）相關的項目。
iPSC-NK培養方案
本文將介紹在無飼養層細胞、無血清條件下生成iPSC來源的CD56+/CD3- NK細胞培養方案[2]，這些細胞表達NKG2D、NKp30等激活受體，并展現出對A549肺癌、PC3前列腺癌及GBM10膠質瘤等實體瘤靶點的細胞毒性、脫顆粒和IFN-γ分泌功能。
圖2 iPSC-NK的培養流程[2]
材料準備
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樣本：人iPSC細胞 |
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造血分化誘導培養基（HPDM） 培養基：STEMdiffTM APEL 2 細胞因子及小分子：40 ng/mL SCF、20 ng/mL BMP4、 20 ng/mL VEGF、10 μM ROCK 抑制劑 |
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NK分化培養基 培養基：STEMdiffTM APEL 1 細胞因子：20 ng/mL SCF、20 ng/mL IL-7、10 ng/mL IL-15、10 ng/mL FLT3L、5 ng/mL IL-3 |
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NK擴增培養基 培養基：T細胞培養基、5% hAB血清、1%青霉素/鏈霉素、0.2 mM L-谷氨酰胺 細胞因子：10 ng/mL IL-15、500 IU/mL IL-2、25 ng/mL IL-21 |
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其他試劑：hPSC培養基、EDTA、基質膠 |
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耗材：6孔板、24孔板、超低吸附96孔圓底板、離心管等 |
復蘇和培養iPSC
復蘇iPSC，用hPSC培養基培養4-5天至80%匯合度。用0.5 mM EDTA/PBS消化傳代。
iPSC細胞向造血組細胞分化（0-11天）
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將iPSC以3000個/孔接種于超低吸附96孔圓底板，每孔加入100 μL 的含10 μM ROCK 抑制劑的造血分化誘導培養基(HPDM)；
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將接種了細胞的培養板以220 g離心5 min以促進EB形成, 并在37°C、5% CO?靜置培養3天；
注：接種細胞數少于或多于3000個均會導致EBs出現形態異常，導致經11天分化后造血前體細胞的產量降低。
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在第3、6、9天進行換液，從每孔中移除70 μL培養基，并加入100 μL不含ROCK抑制劑的HPDM；
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第11天用大口徑P200移液管將EB轉移至NK細胞分化培養基中。在此階段可收集造血祖細胞用于流式細胞術分析，所述細胞表達為CD34+，被視作成功誘導出造血祖細胞群體。
注：
1）在進行第3天造血細胞分化后，這些培養物形成了類胚體結構，并在隨后的8天內表現出造血前體細胞的發育與增殖。
2）若類胚體培養物在整個11天的分化過程中保持圓形形態并持續生長，則被視為健康狀態。形狀圓潤、表面光滑且生長連續的類胚體，其分化后獲得的NK細胞純度更高。
造血組細胞向NK分化（11天-4周）
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將造血祖細胞以32個EBs/孔接種于6孔板，每孔4 mL NK分化培養基，僅第1周添加5 ng/mL的IL-3，后3 周加入不含 IL-3 的 NK 分化培養基，每周2次換液，采用半量換液的方式；
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經過4周的NK細胞分化培養后，收集細胞，通過流式細胞術進行表型分析，所述細胞表達為CD56+CD3-。
NK細胞擴增（第4周末-8周）
在T細胞擴增培養基中擴增3-4周，該擴增培養基補充有5% hAB血清、1%青霉素/鏈霉素、0.2 mM L-谷氨酰胺、10 ng/mL的IL-15、500 IU/mL的IL-2和25 ng/mL的IL-21，之后進行細胞毒性和功能實驗。
NK細胞的鑒定
常用表面標記物組合
CD3-/CD56+是檢測血液循環中典型 NK 細胞的組合標志物。
NK細胞表面標記物鑒定[2]
NK細胞功能評估相關標志物
活化標志物在腫瘤殺傷過程中起到重要作用。常用檢測指標：NKp44、NKp46、NKp30、NKG2D等；抑制性受體確保 NK細胞不攻擊正常健康細胞。常用檢測指標為：NKG2A、KIRS等。
NK功能相關標志物[2]
近岸蛋白可提供iPSC誘導分化NK細胞過程中用到的一系列細胞因子，包括BMP4、bFGF、VEGF、FLT3L、SCF、IL-3、IL-7、IL-15等，以及iPSC擴增培養常用Vitronectin、Laminins等基質蛋白，高活性，高穩定性，高批間一致性，助力高效穩定的iPSC研究！
iPSC-NK相關產品列表
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參考文獻
[1] Wei X, Su C, Liu Y, Wei N, Xiang K, Qian Q, Xu Z. IPSCderived NK cells for immunotherapy and therapeutic perspective (Review). Mol Med Rep. 2025 Aug;32(2):222. doi: 10.3892/mmr.2025.13587. Epub 2025 Jun 6. PMID: 40476558; PMCID: PMC12174902.
[2]Lupo KB, Moon JI, Chambers AM, Matosevic S. Differentiation of natural killer cells from induced pluripotent stem cells under defined, serum- and feeder-free conditions. Cytotherapy. 2021 Oct;23(10):939-952. doi: 10.1016/j.jcyt.2021.05.001. Epub 2021 Jul 14. PMID: 34272175.