Cas蛋白（CRISPR-associated proteins），即CRISPR相關蛋白，是一種核酸內切酶，能夠識別DNA序列，并切割DNA雙鏈，實現基因的定向修改。cas這個概念首次出現在2002年Ruud. Jansen于Molecular microbiology雜志上發表的文章中，他們通過計算機分析發現了cas相關基因，鑒定了4個在細菌和古菌中的cas基因，包括cas1、cas2、cas3和cas4，其總是位于CRISPR基因座附近，表明和CRISPR基因座具有功能相關。其中Cas3和Cas4蛋白氨基酸序列存在保守結構域，根據氨基酸序列比對推測Cas3可能存在核酸解旋酶活性，Cas4可能存在核酸外切酶活性。研究提示Cas蛋白可能在CRISPR基因座中發揮作用^[1]。此后，相關核心蛋白Cas家族不斷擴展與演化，呈現出令人驚嘆的功能多樣性。

CRISPR基因座及全部四個cas基因的遺傳結構示意圖^[1]

2005年，法國科學家Alexander Bolotin發現了一個新的與CRISPR關聯的cas基因，其中被稱為Cas5的大蛋白（>1100aa）引起人們的關注，它可能參與DNA的切割^[2]。在同一年，Haft等人通過系統分析，識別并命名了多個與CRISPR系統相關的新蛋白家族，其中包括Csn1。Csn1被歸類為與CRISPR位點緊密相關的蛋白質家族之一^[3]。

隨著CRISPR-Cas系統研究地不斷深入，時間來到2011年，在Makarova等人于發表的綜述文章中首次系統地將CRISPR–Cas系統劃分為三大類，并對各類系統中的關鍵蛋白進行了統一命名。在該文中，原先被稱為Cas5、Csn1或Csx12的蛋白被正式命名為Cas9，且屬于II型系統，并發現從侵襲的DNA中選擇間隔區前體（原間隔區）似乎是通過識別原間隔區相鄰基序（PAM）來確定的^[4]。

隨后在2012年的Jennifer與Emmanuelle在文獻中徹底解析了Cas9蛋白的作用機制。Cas9蛋白含有兩個具有切割活性的結構域：HNH結構域和RuvC結構域，HNH結構域切割互補DNA鏈，而RuvC結構域切割非互補DNA鏈。其特性是依賴NGG型PAM（靶點下游3bp），像一把魔力剪刀切割DNA雙鏈并產生平末端。優勢在于操作簡單、技術成熟、基因編輯效率高；劣勢則是易引發脫靶風險。

Cas9 結構域結構的示意圖（來自Emmanuelle Charpentier，2012）

近岸蛋白開發的Cas9蛋白（Cat.No.:E365）以及Cas9蛋白突變體（Cat.No.:E376、Cat.No.:E377、Cat.No.:E378、Cat.No.:E379），在蛋白兩端加入核定位信號（NLS），可使蛋白進入細胞核內進行基因組編輯，配合一對gRNA使用，可實現Cas9 Nuclease相同的基因編輯效果，由于有效的識別序列由20bp增加至40bp，能明顯降低脫靶風險，高效助力基因編輯！

圖例）將不同Cas9/sgRNA RNP復合物通過電轉方式遞送至293T細胞，48h后收集細胞，抽提基因組DNA。T7EI檢測結果表明：相同條件下，近岸蛋白的Cas9蛋白切割效率要優于其他同類品牌。

2015年，張鋒團隊發現了新型V型CRISPR系統代表酶——Cas12a（原名Cpf1），它具有與Cas9不同的特性，識別的是TTTV（V=A/C/G）型的PAM序列；切割DNA后會產生黏性末端，更利于基因插入修復；僅需crRNA單鏈引導，無需tracrRNA，簡化了編輯系統；蛋白結構更小，更適合病毒載體包裝和體內遞送。

Cas12a蛋白的RuvC和核酸酶葉（NUC）結構域具有裂解活性。一旦Cas12識別到PAM序列，就會使得crRNA與目標DNA鏈之間互補配對形成R-loop，Cas12a蛋白利用其RuvC結構域活性，在PAM序列的幫助下切割非目標鏈。Cas12a蛋白的切割功能被激活后，會切割周圍的非特異性單鏈DNA，這種現象被稱之為反式切割，這一特性可被用作核酸探針。

Cas12b（又名C2c1）最早是在2015年被Kira S. Makarova等人作為一種新型CRISPR效應蛋白在系統分類學研究中提出的，并在隨后幾年中被進一步功能化、應用化。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小，來源于嗜酸耐熱菌如Alicyclobacillus acidoterrestris，具有較高切割活性。Cas12b的最佳切割反應溫度為48℃。與Cas12a類似，Cas12b識別5'-TTN型PAM序列，切割DNA后產生粘性末端。不同的是，Cas12b依賴雙RNA導向（crRNA和tracrRNA，或連接后形成的sgRNA）。此外，Cas12b不僅可以應用于靶標dsDNA的切割，還可以用于靶標核酸的快速檢測。

近岸蛋白開發的臨床級零脫靶率的AaCas12b^Max（Cat.No.:E375）和高編輯效率的enCas12Ultra（Cat.No.:E393），脫靶效率更低，成本更低，是做基因編輯臨床級研究的不二之選。

Cas13是專門針對RNA的VI型CRISPR系統，其在2016年由張峰團隊研究報道。它不依賴于PAM序列，而是識別protospacer flanking site（PFS），靶向并切割單鏈RNA（ssRNA）。Cas13使用單一crRNA引導，具備順式切割（針對目標RNA）和反式切割（激活后非特異性降解周邊RNA）能力，因此常被稱為“沉默獵手”。由于其對RNA的特異性作用，Cas13不涉及基因組DNA的編輯，安全性更高。它已被廣泛應用于病毒檢測（如張鋒團隊開發的SHERLOCK系統）、RNA追蹤與調控，甚至在神經科學中用于將RNA輸送至特定亞細胞結構。

近岸蛋白開發的LwaCas13a Nuclease（Cat.No.:E381），源自Leptotrichia wadei(Lwa)細菌，采用大腸桿菌重組表達，純度超過95%，既可以用于體外RNA切割，體外RNA檢測，也可用于活細胞RNA的調控、RNA基因編輯，同時也可以用于光學探針生物學標記。

Cas14（現多被歸類為Cas12f）屬于VII型CRISPR系統，由Makarova等人提出，體積極小，僅約400–700個氨基酸殘基，是目前已知最小的CRISPR效應核酸酶之一，因此被稱為“暗器大師”。Cas14最初被認為只能靶向單鏈DNA（ssDNA），無需PAM序列；然而，2024年，張恒團隊解析了其機制發現，Cas14可由crRNA-靶RNA配對激活，對mRNA進行高特異性沉默，從而具備RNA調控功能。這一特性使得Cas14成為基因調控和疾病治療（如靶向mRNA降解）中的極具前景工具。由于不切割DNA雙鏈，Cas14在安全性方面優于傳統CRISPR編輯工具，尤其適用于動態調控基因表達，降解病毒RNA（如乙肝、新冠），需要可逆干預的疾病等，是未來的新興領域。

CRISPR-Cas9、 Cas12a、 Cas14和Cas13a基因編輯系統的基本組件（Feng W et al. 2021） 

從精準剪切DNA的Cas9、到既能切雙鏈DNA又能切單鏈探針的Cas12，再到RNA的“獵手”Cas13和“暗器大師”Cas14，CRISPR技術正在全速進化。CRISPR系統已不再只是簡單的編輯工具，而逐漸變成一整套可調控、診斷甚至治療的生物技術平臺。未來，隨著更多CRISPR子系統的發現和工具化，人類將擁有更精細、更安全、更智能的“基因工具箱”去對抗疾病、調控生命。今天關于Cas蛋白的解析就到這里啦！下期近岸蛋白將詳細解析CRISPR/Cas系統的另一個核心組件sgRNA，下期不見不散！