Cell重磅(IF=45.5!)｜哈佛大學研究團隊直擊革蘭陰性菌血流感染：鎖定關鍵酶SpeG，靶向多胺乙?；孓D抗生素耐藥

英文標題：A metabolomics pipeline highlights microbial metabolism in bloodstream infections

中文標題：代謝組學研究流程揭示血流感染中的微生物代謝特征

發表期刊：Cell

影響因子：45.5

研究背景

隨著抗菌藥物耐藥性(Antimicrobial-Resistant, AMR)的加劇，識別細菌致病過程中可干預的代謝功能成為臨床迫切需求。盡管嚴重感染（如血流感染）對宿主代謝的影響已被廣泛研究，但微生物在感染微環境中的代謝活動長期未被重視。AMR相關感染預計于2050年導致全球每年1000萬人死亡，而革蘭氏陰性血流感染(Bloodstream Infection, BSI)作為主要致死原因之一，因現有抗生素靶點有限、耐藥機制復雜，治療選擇亟待拓展。

這篇文章描述了一種迭代比較代謝組學的流程，以揭示宿主復雜環境中的微生物代謝特征，并將其應用于研究患者的革蘭氏陰性BSI。研究團隊發現，在血流感染期間，細菌來源的乙?；喟匪缴?，并識別出了負責這些多胺生產的酶SpeG。通過阻斷SpeG活性，可以減少細菌的增殖并減緩病理進程。此外，降低SpeG活性還增強了細菌膜的通透性，增加了細胞內抗生素的積累，有助于克服抗生素抗性。這項研究強調了在感染的自然背景下研究病原體代謝的工具如何揭示和優先考慮治療策略，以應對復雜的感染。

技術路線

研究結果

1.通過迭代比較代謝組學流程篩選BSI中微生物來源的代謝物

為識別BSI患者血漿中升高的微生物源性代謝物，研究者設計了患者樣本→小鼠模型→細菌培養的迭代比較代謝組學流程（圖1A）。研究聚焦于革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等AMR相關病原體），通過液相色譜-質譜(LC-MS)分析，在BSI患者與對照組中鑒定出62種差異代謝物，其中8種與疾病嚴重程度（APACHE II評分）顯著相關（圖1B）。

通過盲腸漿小鼠模型（活菌感染組vs.熱死菌刺激組vs.無菌對照組），研究者進一步確認5種代謝物（如N-乙酰腐胺）僅在活菌感染中升高，排除宿主炎癥反應的影響（圖1C）。細菌培養實驗顯示，大腸桿菌和肺炎克雷伯菌可產生N-乙酰腐胺，而銅綠假單胞菌（包括多重耐藥臨床分離株）還可將其進一步生成4-乙酰氨基丁酸（圖1F）；小鼠體內實驗表明，哺乳動物僅能微量生成類似代謝物，但可將外源N-乙酰腐胺轉化為4-乙酰氨基丁酸，提示宿主可能參與部分代謝物的轉化。

該流程通過 “宿主-微生物-體外培養” 多維度生物過濾，精準鎖定微生物源性代謝物，為后續揭示致病菌代謝機制奠定基礎。

2.迭代比較代謝組學流程能夠對非靶標代謝組學數據集中的特征進行優先排序

研究者利用非靶標代謝組學技術解析復雜患者樣本，旨在識別細菌特有的未知代謝物（圖2）。通過迭代流程對30,371個原始特征進行篩選：首先通過質量控制保留13,838個特征，利用親水性相互作用液相色譜-正離子模式(HILIC-pos)從中選出899個差異特征；進一步通過盲腸漿小鼠模型排除宿主干擾，剩余148個特征；最終在3種大腸桿菌菌株和2種培養基條件下，確認23個特征與人類和小鼠數據一致（圖2A）。

通過兩項生物學標準對特征優先級排序：①與疾病嚴重程度評分(APACHE II)的關聯性；②結合MACCARoN計算工具預測的代謝關聯性。重點研究的未知特征230和114，經MS²質譜分析、核磁共振(NMR)及¹³C穩定同位素標記實驗，分別鑒定為N1,N8-二乙酰亞精胺和2-或3-乙酰吡咯烷異構體（圖2D-F）?？缒Ｐ万炞C顯示，這些代謝物在雌性小鼠、盲腸結扎穿孔(CLP)模型及單菌株感染模型中均呈現一致變化，證實結果的穩健性。

3.SpeG同系物在革蘭氏陰性桿菌中產生N-乙酰腐胺和二乙酰亞精胺

研究者探索了BSI期間多胺乙?；闹匾?，確定SpeG同系物為革蘭氏陰性菌中催化該過程的關鍵酶（圖3）。聚焦于大腸桿菌(E. coli)中N-乙酰腐胺和二乙酰亞精胺的合成（此前其在BSI中的作用未明確），推測多胺/二胺N-乙酰轉移酶為候選酶，尤其關注大腸桿菌和肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)普遍表達的SpeG酶。

通過敲除大腸桿菌BW25113的ΔspeG突變株，發現speG缺失導致N-乙酰腐胺和二乙酰亞精胺完全消失，而質?；パaspeG基因可恢復代謝物生產（圖3A）。純化的SpeG酶可催化腐胺乙?；?，動力學顯示其對腐胺具正協同機制，對亞精胺的活性接近最大速度，提示其在生理條件下主要調控亞精胺穩態。

在銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)中，通過同源序列比對和功能互補實驗，鑒定PA1472為SpeG同源物。其對腐胺的動力學參數與SpeG相似，且結構預測顯示二者具高度相似性（圖3H）。人類同源物SAT1對腐胺的親和力遠高于真核細胞內濃度，表明其在生理條件下對腐胺乙酰化貢獻可忽略。

4.SpeG活性的喪失損害了大腸桿菌在培養和體內的適應性

多胺在調控基因表達、蛋白質翻譯及細胞膜穩態中起關鍵作用，但其高濃度毒性需通過SpeG酶的乙?；饔弥泻碗姾梢試栏裾{控。SpeG缺失在不同病原體中功能差異顯著：沙門氏菌中阻礙胞內增殖，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)USA300株中削弱對宿主多胺的抵抗力，而志賀氏菌則通過沉默speG促進亞精胺積累以適應環境。

在大腸桿菌中，實驗室菌株BW25113的ΔspeG突變株在基礎培養中與野生型無增殖差異，但臨床分離株（如E23、M1/5）敲低speG表達（CRISPRi系統，aTc誘導）后出現顯著生長缺陷：胞外N-乙酰腐胺和二乙酰亞精胺減少，胞內腐胺積累增加。體內實驗顯示，抑制E. coli E23的speG表達可延遲小鼠死亡，且BW25113ΔspeG株在感染模型中脾臟菌落形成單位(CFU)顯著減少，表明SpeG對病原體體內適應性至關重要。

這些發現揭示，SpeG的功能依賴于細菌遺傳背景，其在臨床分離株中的必需性提示多胺乙?；荁SI中病原體代謝的關鍵脆弱點（圖4）。

5.Diminazene抑制SpeG，減少細菌增殖

盡管SpeG的小分子抑制劑尚未被報道，但人源多胺N-乙酰轉移酶SAT1的抑制劑已用于抗癌研究。獸藥diminazene（SAT1抑制劑）對大腸桿菌SpeG亦具抑制作用，其體外IC₅₀為26.2±3.7 mM（以腐胺為底物），對亞精胺底物的IC₅₀為590.1±30.8 mM，顯示廣譜抑制特性（圖5B）。

Diminazene處理可降低胞外N-乙酰腐胺和二乙酰亞精胺水平，同時導致胞內腐胺積累、N-乙酰腐胺比例下降（圖5C-D），并以劑量依賴性方式抑制細菌生長（圖5E）。CRISPRi抑制speG表達后，大腸桿菌對diminazene的生長抑制產生抗性（圖5F），證實其作用依賴SpeG活性。在多重耐藥臨床分離株中，diminazene的MIC₉₀值顯示其可作為工具化合物，用于研究多胺乙?；诟锾m氏陰性病原體中的功能（圖5I-J）。需注意，diminazene對哺乳動物毒性較高，其在本研究中主要用于機制驗證，而非直接作為治療藥物。

6.抑制多胺乙?；黾蛹毦ねㄍ感圆⑴c臨床抗生素協同作用

多胺在細胞內調控DNA復制、轉錄、蛋白質翻譯及細胞膜穩態等過程，這些路徑與抗生素靶點（如DNA拓撲異構酶、膜蛋白）高度重疊。研究發現，抑制細菌SpeG酶活性可增強抗生素敏感性，其機制包括：

膜通透性增加：SpeG缺失或抑制（如diminazene處理）導致胞內腐胺積累，破壞大腸桿菌內外膜完整性。實驗顯示，外膜探針(NPN)和內膜探針(PI)熒光強度顯著升高，表明雙膜通透性增強（圖6C-D）。

抗生素協同效應：萬古霉素（僅作用于革蘭氏陽性菌）在SpeG抑制下，MIC₉₀從>128 μg/mL降至32-64 μg/mL，提示膜損傷使大分子抗生素得以進入胞內（圖6A-B）。diminazene與四環素、環丙沙星在多重耐藥(MDR)菌株中表現出協同作用，部分菌株MIC₉₀降至臨床敏感閾值以下（圖7A）。

作用機制特異性：與pentamidine不同，diminazene通過抑制胞內SpeG間接誘導膜損傷，而非直接破壞外膜，其效應可被CRISPRi抑制speG完全逆轉（圖5F）。

體內實驗證實，diminazene+四環素聯合治療可顯著延長四環素耐藥大腸桿菌感染小鼠的生存時間（圖7C），為靶向SpeG增強現有抗生素療效提供了跨模型證據。

這項研究開發了迭代比較代謝組學流程，通過分析革蘭氏陰性血流感染患者血漿、小鼠模型及細菌培養樣本，鑒定出微生物特異性代謝物如N-乙酰腐胺，確認其由SpeG酶家族催化生成。SpeG在大腸桿菌、銅綠假單胞菌等病原體中通過乙酰化多胺調控膜穩態，其活性喪失會損害細菌體內外適應性。小分子抑制劑diminazene可抑制SpeG，增加細菌膜通透性，與萬古霉素、四環素等臨床抗生素產生協同效應，逆轉多重耐藥表型。研究還發現N-乙酰腐胺等代謝物可能作為BSI診斷標志物，并提出開發微生物特異性SpeG抑制劑的潛力，為應對抗生素耐藥提供了新策略。

研究強調代謝組學在區分宿主與微生物代謝中的價值，通過多維度生物過濾鎖定病原體關鍵代謝路徑，結合酶動力學差異驗證SpeG作為安全治療靶點的可行性。體內實驗證實diminazene與抗生素聯用可提高耐藥菌感染小鼠生存率，為臨床干預提供了跨模型證據，凸顯了靶向細菌代謝在抗耐藥感染中的重要意義。