J Ethnopharmacol.｜福中醫研究團隊新發現！清解扶正顆粒精準操控巨噬細胞，讓結直腸癌“剎車”！

英文標題：Mechanism of Qingjie Fuzheng Granules in inhibiting colitis associated colorectal cancer by regulating TLR4 and IL-4R mediated macrophage polarization

發表期刊：Journal of Ethnopharmacology

影響因子：5.4

合作單位：福建中醫藥大學

百趣提供服務：DIA中藥入血組、中藥NGM 2

清解扶正顆粒(QFG)是一種中藥復方，已被用作結腸炎相關結直腸癌(CAC)的輔助治療，但其作用機制尚不明確。福建中醫藥大學研究團隊在Journal of Ethnopharmacology(IF=5.4)上發表了題為“Mechanism of Qingjie Fuzheng Granules in inhibiting colitis associated colorectal cancer by regulating TLR4 and IL-4R mediated macrophage polarization”的研究文章，旨在探究QFG抗CAC的潛在機制是否與巨噬細胞極化相關，通過動物及細胞模型，最終證實了，QFG中的多種單體成分可分別結合MD2或IL-4R，通過誘導巨噬細胞極化從而抑制CAC的發生發展。

1.QFG的活性成分與TLR4/MD2受體復合物或IL-4受體表現出強結合親和力

為探究QFG抑制CAC發生的機制是否與巨噬細胞極化相關，研究人員先利用非靶向代謝組學對QFG粉末的成分進行了鑒定（圖1A-B），其鑒定出的化合物與Biotree TCM和BT-HERB數據庫中的1506個條目匹配。

有研究表明，TLR4/MD2受體復合物和IL-4R介導的通路在調節M1型和M2型巨噬細胞中至關重要，因此研究人員利用分子對接分析，對探究QFG與其的關系，結果共鑒定出10種活性成分與TLR4/MD2受體復合物以及IL-4R之間均具有強結合親和力，表明QFG具有調節巨噬細胞極化的潛力（圖1C）。

2.QFG改善CAC小鼠的癥狀并抑制腫瘤發展

為了更加清楚QFG的作用機制，研究人員構建了CAC小鼠模型，6只/組，共設計了4個實驗分組，分別是Control組、Model+QFG組、Model組、QFG組（圖2A）。喂養期間進行了體重記錄、糞便隱血評分、腹瀉指數評分；2個月后，分別記錄了每只鼠的結腸長度、結腸表面腫瘤數量、肝臟、胸腺和脾臟的重量（圖2B-C），并對結腸組織進行HE染色，同時采集血樣用做其他分析。

結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠的結腸長度顯著縮短、腫瘤數量增多、脾指數顯著升高、體重下降、腹瀉和便血等情況均被QFG改善，且并未造成肝腎功能損傷（圖2D-E）；此外，QFG對結腸的生理結構也有一定改善（圖2F）。這些數據表明，QFG可以抑制CAC小鼠的腫瘤發展。

3.QFG調節CAC小鼠腸道組織的巨噬細胞極化

流式和免疫組化實驗顯示，M2樣標志物CD206呈現顯著下降，而M1樣標志物CD11c則顯著增加，表明QFG可以增加M1樣巨噬細胞的存在并減少M2樣巨噬細胞的數量（圖3A)；此外，相較對照組，模型組中F4/80、CD68及離子鈣結合適配分子(IBA1)的表達水平較對照組顯著升高，表明QFG能有效減輕由AOM/DSS誘導的小鼠CAC結腸黏膜炎癥（圖3B-D）。

與此同時，在AOM/DSS誘導的CAC模型中，與對照組相比，巨噬細胞M2標志物、巨噬細胞M1標志物的表達量顯著升高，但QFG處理后，CD206和精氨酸酶1的表達量顯著降低(圖3E-F），同時CD11c和CD86的表達量明顯增加(圖3G-H），這些結果表明，相較于模型組，QFG可促進M1樣巨噬細胞的募集，同時抑制M2樣巨噬細胞的浸潤。這些結果與流式細胞術獲得的數據一致。

4.QFG在體外促進Ana-1巨噬細胞向M1型表型極化

為驗證QFG對M1樣表型的促進作用，研究人員在體外實驗中檢測了QFG對Ana-1細胞中CD80、CD86、CD11c、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和iNOS水平的影響。流式實驗顯示，QFG處理后CD80、CD86和CD11c的熒光強度呈現顯著劑量依賴性增強（圖4A)。RT-qPCR分析表明，IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和iNOS的mRNA表達量也呈QFG劑量依賴性上升（圖4B)。此外，TNF-α、MCP-1和IL-6的蛋白表達量也出現類似增長（圖4C)。這些結果有力證明了QFG能夠促進Ana-1巨噬細胞向M1樣表型轉化。進一步實驗顯示，經QFG處理后TRITC-葡聚糖的熒光強度呈現劑量依賴性增強，表明QFG能顯著提升Ana-1細胞的吞噬活性（圖4D）。此外，CT26細胞共培養實驗表明，與單獨使用CT26細胞的對照組相比，Ana-1+CT26聯合治療組的細胞凋亡率顯著升高（圖4E）。這些結果進一步證實，QFG不僅能誘導Ana-1巨噬細胞向M1樣表型轉變，還能增強其吞噬和細胞毒性功能。

5.當受到IL-4或CT26細胞培養上清刺激時，QFG在體外可抑制Ana-1巨噬細胞向M2型表型極化

研究人員進一步探究QFG處理是否能誘導Ana-1巨噬細胞向M2樣巨噬細胞轉化。RT-qPCR結果顯示QFG處理抑制了Ym1和CD206 mRNA的表達，同時促進了精氨酸酶1和IL-10 mRNA的表達（圖5A）。此外，研究人員利用兩種體外模型：IL-4誘導的M2樣巨噬細胞和CT26細胞培養上清液誘導的M2樣巨噬細胞，進一步探究QFG處理抑制M2樣巨噬細胞形成的潛力。結果發現，IL-4成功誘導了M2樣巨噬細胞（圖5B）。此外，兩種模型在QFG處理后，精氨酸酶1和CD206 mRNA表達量均顯著受到抑制（圖5C)。這些結果表明，QFG能顯著影響暴露于IL-4或CT26細胞培養上清液誘導的M2樣巨噬細胞。

6.TLR4通路參與QFG誘導的M1型巨噬細胞極化

研究發現，TLR4和IL-4R分別參與調節M1型和M2型極化，為了探究QFG對巨噬細胞的極化作用是否與他們相關，研究人員用6種不同的TLR4及其下游通路物質拮抗劑對Ana-1細胞進行處理后，用QFG干預。結果顯示，除KG501外，其他5種拮抗劑均不同程度地減弱了QFG誘導的IL-6、TNF-α、iNOS或IL-1β mRNA的上調（圖6A-F）。表明QFG誘導巨噬細胞向M1型極化與TLR4和IL-4R及其相關的通路相關。

為深入探究MD2與QFG誘導巨噬細胞極化之間的關系，研究人員構建了Sh-MD2（MD2敲除）慢病毒轉染Ana-1細胞，并用QFG進行干預。結果顯示，與NC組相比，Sh-MD2組的MD2 mRNA和蛋白表達量顯著降低（圖7A-B），表明成功構建了MD2敲低的Ana-1細胞系。此外，相較于NC組，Sh-MD2組的IL-6、IL-1β和iNOS mRNA水平下降（圖7C），而在MD2敲低的Ana-1細胞中，使用QFG處理并未導致IL-6、IL-1β、iNOS和TNF-α的mRNA水平顯著升高，說明QFG促進巨噬細胞向M1樣表型轉化的作用與MD2密切相關。

7.IL-4R通路參與QFG誘導的M2型巨噬細胞極化

此外，研究人員進一步探究了QFG抑制IL-4誘導的M2樣巨噬細胞是否與IL-4受體(IL-4R)及其下游STAT6和PI3K/Akt信號通路相關。通過Western blot檢測STAT6、p-STAT6、Akt及p-Akt蛋白水平。結果顯示，與對照組相比，IL-4誘導的p-STAT6和p-Akt水平顯著升高），而經QFG干預后兩者均顯著降低（圖8A）。這些結果表明，QFG可能通過拮抗IL-4受體介導的STAT6和PI3K/Akt信號通路，抑制Ana-1細胞向M2樣極化的進程。

本研究中，研究人員驗證了清解扶正顆粒(QFG)中的單體成分能夠與MD2或IL-4R結合，通過TLR4介導的NF-κB、MAPK和PI3K/Akt通路激活巨噬細胞向M1型表型極化，或通過抑制IL-4R介導的JAKs通路抑制巨噬細胞向M2型表型極化，最終會抑制結直腸癌的發生和發展，為QFG在CAC治療中的潛在應用提供了有價值的見解。

然而，研究也發現過多的巨噬細胞向M1型表型轉化可能會對腸道組織造成炎癥損傷，最終加劇CAC的嚴重程度。因此，精確調控QFG的給藥劑量對于防止巨噬細胞過度激活為M1型表型至關重要。