英文標題：GPR25 promotes the formation of lung and liver tissue-­resident memory CD8 T cells

中文標題：GPR25促進肺和肝組織——常駐記憶CD8 T細胞的形成

發表期刊：Science Immunology

影響因子：16.3

研究背景

組織駐留記憶CD8 T(TRM)細胞提供關鍵的抗病毒和抗腫瘤免疫，但指導其發展的分子途徑尚未完全確定。

研究團隊發現G蛋白偶聯受體GPR25是由轉化生長因子-β(TGF-β)信號誘導的TRM細胞形成的調節劑。研究結果表明，調節GPR25功能可能為改善感染和癌癥中的TRM細胞反應提供一種治療策略。

研究結果

01 -TGF-β誘導CD8 T細胞中GPR25的表達

免疫細胞表達、eQTLs和表觀基因組學數據庫的分析證實，與非TRM細胞亞群和循環CD8 T細胞亞群相比，GPR25和TRM細胞相關基因在肺TRM細胞中顯著富集(圖1A-B)。TGF β處理可快速誘導原代人CD8 T細胞中GPR25的表達，這些細胞通過抗CD3和抗CD28 抗體在體外多克隆激活（圖1C）。與非TRM細胞相比，GPR25轉錄起始位點上游的三個區域（C1、C2和C3），在腫瘤浸潤性TRM細胞中顯示出突出的轉座酶可及峰（ATAC-seq峰），表明GPR25的表達可能受到這些信號通路的共同調節（圖1D）。

與在人T細胞中觀察到的類似，在體外通過TCR和CD28交聯激活的小鼠CD8 T細胞中，TGF-β有效誘導Gpr25的表達，但其表達水平隨時間逐漸下降（圖1E）。此外，在未處理的野生型C57BL/6小鼠中，表達 TRM細胞標記物CD69的小腸上皮內淋巴細胞（siIELs）和肝臟 T細胞等非淋巴器官中的CD8 T細胞表達更高水平的Gpr25轉錄物，而脾CD8 T細胞顯示出最小的Gpr25表達（圖1F）。因此，在小鼠和人類中，GPR25是TGF-β誘導基因，在TRM細胞中選擇性表達。

圖1.TGF-β誘導GPR25在CD8 T細胞中的表達

02 -GPR25促進肝臟TRM細胞的發育和維持

為評估GPR25在TRM細胞發育中的相對作用，在感染90天后比較脾臟、肝臟和siIEL室中轉移的T細胞的細胞頻率和記憶表型（圖2A），發現相同比例的GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T細胞（圖2B）。正如預期的那樣，肝臟TRM細胞（CD69+）共表達CXCR6，但缺乏CD103的表達，GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T細胞在siIEL室中TRM細胞的頻率沒有顯著差異（圖2C），這表明Gpr25對于siIEL室中TRM細胞的發育是不可缺少的。

使用異體共生實驗來評估GPR25-WT和GPR25-KO肝臟TRM細胞的駐留潛力（圖2D）。共生30天后，GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T細胞在宿主肝臟中以相同比例積累，但在CD8-KO配對受體小鼠的脾臟中觀察到GPR25-KO OT-I T細胞與GPR25-WT OT-I T細胞的比例明顯更高（圖2E）。因此，組織中缺乏GPR25的T細胞表現出降低的駐留潛力，更有可能重新進入循環，這表明GPR25支持肝臟TRM細胞的發育。

圖2.GPR25促進肝臟TRM細胞的發育

03 -Gpr25缺乏會損害TRM細胞發育的早期階

為評估GPR25是否影響TRM細胞發育的早期階段，通過比較比較LCMV-OVA感染后肝臟中過繼共轉移GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T細胞在早期時間點的表型（圖3A），感染后的48小時內觀察到細胞的激活和增殖狀態沒有差異（圖3B），感染后的第5天、12天和30天，細胞的比例相等，Gpr25缺乏對肝臟中轉移的OT-I T細胞的KLRG1+效應表型沒有可測量的影響，少量轉移的OT-I T細胞共表達肝臟TRM細胞標志物CD69和CXCR6。

然而，在感染后第12天觀察到肝臟中存在明顯的CD69+CXCR6+OT-I T細胞群，表明潛在的TRM前體細胞的形成（圖3C-E）。Gpr25缺陷導致這些TRM前體細胞減少，肝臟中KLRG1+效應細胞相應增加（圖3D）。然而，脾臟中CD69+CXCR6+ OT-I T細胞的頻率非常低，GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T細胞在任何時間點上均無顯著差異（圖3E）。這些發現表明，gpr25缺陷T細胞產生肝臟TRM細胞的受損不太可能是由于脾臟TRM前體細胞頻率的改變。

圖3.Gpr25缺乏損害TRM細胞發育的早期階段

04 -GPR25支持干細胞樣TRM細胞的產生

差異基因表達分析顯示肝臟GPR25-WT和GPR25-KO TRM細胞的轉錄譜存在顯著差異（圖4A）。與GPR25-KO TRM細胞相比，GPR25-WT TRM細胞對干細胞樣T細胞特征表現出陽性富集，對效應物相關特征的富集程度降低（圖4B）。對肝臟組織駐留記憶T細胞（TRM）進行無監督亞群分析，發現存在異質性亞群：主要簇1和3富含干細胞樣特征及相關基因（Tcf1和Lef1），而簇0和2則富含效應基因（如Klrg1、Prf1、Gzma、Gzmb和GzmK）（圖4C-E）。RT-qPCR和細胞內染色證實，GPR25-WT中TCF1編碼的轉錄本和TCF1蛋白水平高于GPR25-KO肝TRM細胞（圖4F-G）。

使用繼發性轉移方法來確定Gpr25缺陷是否影響肝臟中繼發性TRM細胞的產生（圖4H）。感染30天后觀察到肝臟中轉移的GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T細胞數量大致相等（圖4I），表明GPR25-KO TRM細胞在肝臟中遷移和產生記憶T細胞的能力沒有重大缺陷。

然而，與GPR25-WT TRM細胞相比，GPR25-KO TRM細胞在肝臟中分化為繼發性TRM細胞（CD69+CXCR6+）的頻率顯著降低（圖4J）。

相比之下，效應記憶T細胞（TEM）（KLRG1+CD62L−CD69−）的頻率增加（圖4K）。這些結果表明，GPR25-KO TRM細胞在抗原再激發后分化為次級TRM細胞的能力存在缺陷。

圖4.GPR25促進干細胞樣TRM細胞的發育

05 -GPR25增強T細胞對TGF-β的應答

與受體小鼠肝臟中的GPR25-KO TRM細胞相比，GPR25-WT TRM細胞中TGF-β特征基因正富集（圖5A）。缺乏TGF-β受體29（Tgfbr2）的表達沒有改變，但在肝臟TRM細胞中TGF-β受體1（Tgfbr1）的表達增加（圖5B）。評估TGF-β信號在LCMV病毒感染模型中的作用（圖5C）。阻斷TGF-β信號通路在LCMV-OVA感染前后30天顯著減少了肝臟中過繼轉移的CD69+CXCR6+的OT-1T細胞的頻率，而不改變第30天時在肝臟中積累的OT-1T細胞的總數（圖5D）。研究發現，與GPR25-WT CD8 T細胞相比，GPR25-KO細胞中磷酸化的SMAD2和SMAD3蛋白（pSMAD2/SMAD3）的表達水平顯著降低（圖5E）。

此外，在CD8 T細胞中過表達Gpr25則表現出更高水平的pSMAD2/SMAD3（圖5F）。利用已發表的來自體外TRM細胞分化模型的RNA-seq數據集首次發現維甲酸（retinoic acid，RA）不會誘導T細胞中Gpr25的表達，而是抑制TGF-β誘導的Gpr25的表達（圖5G）。接下來，在這個體外模型中評估了RA是否可以在缺乏Gpr25的情況下驅動TRM細胞分化（圖5H）。正如預期的那樣，與GPR25-WT T細胞相比，在TGF-β處理的條件下，GPR25-KO CD8 T細胞向CD69+CD103+TRM樣細胞的分化受損（圖5I）。

圖5.GPR25增強T細胞對TGF-β的應答

06 -GPR25促進肺TRM細胞的發育

采用LCMV-OVA感染幼稚CD45.1受體小鼠（圖6A），在肺中觀察到GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T細胞的比例大致相等（圖6B）。感染30天后，在肺部檢測到不同的CD69+CD103+OT-ITRM細胞群，與Gpr25充足的OT-I T細胞相比，缺乏Gpr25的OT-I T細胞在肺部發育為CD69+CD103+TRM細胞的能力降低（圖6C）。

為進一步了解GPR25促進肺中CD69+CD103+TRM細胞發育的機制，通過對GPR25-WT和GPR25-KO OT-I記憶T細胞進行了單細胞轉錄組分析，OT-I T細胞分為兩個主要亞群，在第0簇中觀察到GPR25-WT與GPR25-KO OT-I記憶T細胞的比例更大（圖6D）。與在肝臟TRM細胞中的發現類似（圖4A-D），富含GPR25-WT T細胞的第0簇細胞相對于第1簇顯示出效應相關基因表達減少，而干細胞樣標記的表達增加（圖6E-F）。此外，簇0顯示出TRM細胞特征的強富集（圖6G），表明它主要由TRM細胞組成，與簇1相反（圖6D）。為驗證這些發現，通過GPR25-WT和GPR25-KO OT-I T細胞將CD8-KO受體小鼠分成不同的隊列，然后用LCMV-OVA感染它們（圖6H）。如預期那般，在轉移的GPR25-WT OT-I T細胞中，肺中TCF1+CD69+ CD8 T細胞的頻率明顯高于GPR25-KO OT-I T細胞（圖6I）。通過RT-qPCR分析證實，LCMV感染后第30天，GPR25-KO OT-I細胞中的Zeb2和S1pr5轉錄物水平顯著升高（圖6J）。

圖6.GPR25促進肺TRM細胞的發育

07 - Gpr25缺陷T細胞不能控制肺轉移

為評估Gpr25缺陷記憶T細胞是否在腫瘤攻擊模型中表現出受損的繼發性肺T細胞反應，按圖6A所示，感染30天后使用B16F10-OVA腫瘤細胞刺激受體小鼠以誘導轉移（圖7A）。接種13天后，GPR25-WT OT-I細胞在肺中的出現頻率顯著高于GPR25-KO OT-I細胞（圖7B）。因此假設Gpr25-充足的OT-I記憶T細胞具有更大的控制肺轉移的能力。為驗證該假設，兩組獨立的CD45.1 WT受體小鼠（圖 7C）分別接受GPR25-WT OT-I T細胞或GPR25-KO OT-I T細胞輸注，隨后經氣管內感染LCMV-OVA。感染30天后使用B16F10-OVA細胞進行激發，并在FTY720處理后評估肺轉移程度。結果顯示，與接受GPR25-KO OT-I細胞的小鼠相比，接受GPR25充足的OT-I細胞的小鼠的轉移結節數量顯著減少（圖7D）。

為排除宿主CD8 T細胞的干擾，采用CD8-KO小鼠作為受體，驗證GPR25-WT OT-I T細胞與GPR25-KO OT-I T細胞在控制肺轉移中的作用（圖 7E）。對照組設置為未接受T細胞輸注的CD8-KO小鼠，以專門評估過繼轉移OT-I T細胞的作用。結果顯示，接受GPR25-KO OT-I T 細胞的CD8-KO小鼠存活結局較差，死亡率達50%；而接受GPR25-WT OT-I細胞的CD8-KO小鼠在分析時大多數存活（圖7F）。此外，與接受GPR25-KO OT-I細胞或不轉移OT-I細胞的CD8-KO小鼠相比，接受GPR25-WT OT-I細胞的CD8-KO小鼠的轉移結節數量顯著減少（圖7G）。

圖7.Gpr25缺陷T細胞不能控制肺轉移

研究總結

在轉錄組學調查中，與非TRM細胞相比，GPR25成為肺和腫瘤浸潤性CD8 TRM細胞中差異表達最多的基因之一。

研究發現GPR25在人CD8 T細胞中通過TGF-β信號誘導表達。LCMV感染模型證明了GPR25在支持小鼠肝臟和肺中表達TCF1的干細胞樣TRM細胞的發育中發揮關鍵作用，而不是在siIEL室發育的干細胞。使用TRM生成的其他組織特異性模型的未來研究可用于檢查GPR25在組織室中的作用。鑒于TRM細胞在抗腫瘤免疫應答中的重要性，推斷通過靶向GPR25活性來調節TRM細胞應答的方法可能在相關的臨床環境中有希望。

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LyL 撰文

 SY 校稿