文章標題：Proteomic analysis reveals exercise training induced remodelling of hepatokine secretion and uncovers syndecan-4 as a regulator of hepatic lipid metabolism

發表期刊：Molecular Metabolism

影響因子：7.422

研究背景

非酒精性脂肪肝病 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)被定義為肝臟中脂質的過度積累，是一種普遍的慢性肝病，其病理表現包括肝脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、纖維化等。

運動訓練是在目前沒有批準的藥物療法的情況下治療NAFLD的首選治療方法，然而這一療法的適用性并不廣泛，尤其是對NAFLD發病率最高的肥胖人群而言，因而開發NAFLD的藥物療法十分緊要，而了解運動訓練降低NAFLD嚴重程度的過程可能會為治療這種疾病提供新的思路。

生物組織會分泌激素（尤其是蛋白質）、細胞因子、代謝物和核酸來誘導自分泌、旁分泌和內分泌作用，以調節營養代謝和全身能量穩態。而肝臟分泌的蛋白質也稱為“肝因子”，是組織間的重要通信媒介，同時肝因子分泌失調也是 NAFLD的一個公認特征。

研究內容

01.小鼠運動訓練計劃的驗證

給12只小鼠喂食高脂肪飲食六周使其患得NAFLD，后將其分為久坐對照組和運動訓練組，對六只運動訓練組的小鼠進行6周的運動訓練。在此期間，久坐組小鼠體重增加了約5.3克，而運動組的小鼠體重增加不明顯；與久坐對照組小鼠相比，運動組小鼠體重的增加與較少質量的脂肪組織有關，同時其肝臟甘油三酯含量降低了約52%，最大跑步能力的顯著改善，骨骼肌中電子傳遞鏈的各種亞單位的蛋白質表達也顯著增加，空腹血糖更低，葡萄糖耐量也稍有改善，但兩組之間的骨骼肌質量沒有顯著差異。

02.運動訓練重塑肝細胞內蛋白質組和肝因子分泌蛋白組

通過小鼠體內肝細胞分離后進行的細胞內蛋白組分析發現，相較于對照組，運動組共分析確定的2657種蛋白質中有57種蛋白質顯著增加，80種蛋白質顯著減少。運動組的線粒體功能也得到了改善，另外運動組中的數種腫瘤抑制蛋白（如 PTEN）、參與脂質代謝的蛋白（如RICTOR、PPARα）、抑癌基因（如MYC、MYCN）和氧化應激調節因子（如NFE2L2)上調。PCA分析顯示運動組的重復性更好，而久坐組的變異性更大。

通過小鼠體內肝細胞分離后進行的肝因子分泌蛋白組分析發現，相較于對照組，運動組增加了26種經典分泌蛋白，減少了9種，同時參與脂質氧化和轉運的分泌蛋白上調，而與肝脂肪變性、氧化應激和肝癌相關的蛋白下調，與硫酸乙酰肝素合成和5-羥色胺降解相關的通路上調，而膽固醇合成通路則相對下調。同時與細胞內蛋白質組相比，兩個組別在PCA算法中都展現出較好的重復性。

這些結果表明運動訓練可以調節肝細胞的細胞內蛋白質組和分泌蛋白組，而這些變化會進而調節脂質代謝的各個方面。

相關性分析結果發現，細胞內蛋白組的豐度與相應的分泌蛋白質之間存在顯著負相關，說明運動干預導致的細胞內蛋白質變化并不能很好地預測肝細胞分泌蛋白質的變化。

03.運動組小鼠的肝因子改善離體組織中的脂質代謝和胰島素的作用

對健康小鼠的離體組織進行分組培養，發現運動組小鼠的肝細胞分泌因子不會改變附睪脂肪組織中脂肪的分解或受胰島素調節的2-脫氧葡萄糖攝取情況。

而與久坐組小鼠相比，運動組小鼠的肝因子顯著增加了骨骼肌中受胰島素調節的 2-脫氧葡萄糖攝取，脂肪酸的氧化量也有所上升，同時降低了肝葡萄糖輸出，而脂肪酸攝取、甘油三酯合成、磷脂合成、和肝臟中的總脂質合成在兩組之間并沒有顯著差異。

04.運動反應性肝因子syndecan-4的鑒定

蛋白組的檢測分析結果發現，有55種蛋白質僅由運動組小鼠的肝細胞分泌，其中包括SDC4，而51種蛋白質僅由久坐組小鼠肝細胞分泌。

有文獻表明，人體運動期間血漿SDC4升高，SDC4的多態性與腹部脂肪有關等。而轉錄組的分析結果表示，與久坐不動的小鼠相比，運動訓練的肝臟中Sdc4的表達顯著增加。

05.NAFLD小鼠肝細胞的SDC4特異性過表達

通過6周的高脂肪飲食使小鼠患NAFLD，然后給小鼠靜脈注射含有肝細胞特異性啟動子(TBG)和SDC4(SDC4-AAV)載體或含有亂序DNA(Control-AAV)的相同載體。分析結果顯示，與對照組相比，SDC4-AAV注射組的SDC4在肝臟中的表達增加了2倍，而在其他組織中的表達沒有變化，肝切片中的SDC4分泌增加了80%，同時SDC類其他的因子的表達沒有變化。

06.SDC4的肝臟過表達不會改變能量穩態

實驗結果表明，實驗組SDC4-AAV和對照組之間在體重、個體組織重量、肥胖、食物攝入、每日能量消耗和底物分配上沒有差異，并且肝臟中SDC4表達的增加并不會改變葡萄糖耐量、血漿中的胰島素含量或胰島素的全身作用。游離脂肪酸、總膽固醇和甘油三酯等血漿脂質在各組之間也沒有差異。

07.SDC4減少肝臟脂肪酸的攝取以及肝臟炎癥和纖維化的標志物

與對照組肝臟相比，SDC4-AAV組中的大脂肪變性減少，總脂滴面積總體減少，較小脂滴的占比增加，而面積大于50mm2的較大脂滴減少了40%，較大脂滴的平均面積也有所減少，而肝臟總甘油三酯水平沒有任何差異。脂滴大小和數量的重塑表明SDC4在調節肝臟脂質代謝中可能發揮作用。

雖然脂肪的生成情況在兩組間沒有差異，但SDC4-AAV組的脂肪酸攝取量顯著降低，脂肪酸氧化也有所減少。而對基因表達情況的分析顯示，Sdc4-AAV組中參與SDC4分泌的Caveolin-1的表達隨著SDC4過表達而增加，促炎基因的表達則降低。

以上分析說明，增加肝臟中的SDC4可能會降低肝臟中脂肪酸的攝取率，并可能最終抑制NAFLD誘導的肝臟炎癥和纖維化。

08.細胞外SDC4調節肝細胞脂肪酸的代謝和脂滴形態的變化

使用rSDC4培養比目魚肌和離體肝細胞，并評估胰島素作用和脂肪酸代謝。其結果顯示rSDC4不影響完整比目魚肌中胰島素刺激的葡萄糖攝取，但會減少肝細胞中的脂肪酸攝取和脂質儲存，同時脂肪酸氧化情況沒有顯著變化。脂質代謝方面，rSDC4處理顯著重塑了脂滴大小，雖然不同條件下的脂滴數量沒有差異，但rSDC4給藥使細胞平均脂滴面積減少了20%，細胞內脂滴占據的總面積減少了25%，同時較大脂滴的數量減少。

以上數據說明細胞外的SDC4分泌會影響脂肪酸代謝并減小肝細胞中的脂滴大小。

研究小結

本研究通過蛋白組、轉錄組、代謝組等多組學的聯合分析，發現運動訓練使肝細胞內蛋白質組和分泌蛋白組發生顯著變化，證明了來自受運動訓練小鼠的肝因子對葡萄糖調節組織中的脂肪酸代謝及細胞的胰島素的敏感度起改善作用，同時進一步確定了syndecan-4(SDC4)是一種能夠調節肝臟脂肪代謝的運動反應性肝因子。

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