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Illumina 850k (EPIC)甲基化芯片服務(wù)
DNA的甲基化修飾是表觀遺傳研究中的一個熱點，在基因調(diào)控過程中扮演著重要的角色。它在維持組織特異性表達譜，使細胞獲得并保持特定狀態(tài)中起著重要作用。同時也調(diào)控著染色質(zhì)穩(wěn)定性、印跡基因表達調(diào)控、X染色體失活及抑制病毒和外源基因的表達等生物過程。更重要的是，在許多復(fù)雜疾病或生命過程的發(fā)生、發(fā)展中，也與DNA甲基化對基因的表達調(diào)控密切相關(guān)，這些疾病包括：癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、老化以及發(fā)育。
? ? ??Illumina在原450K芯片巨大成功的基礎(chǔ)上，推出了新一代的DNA甲基化芯片Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片（下文中以850K芯片代稱），為研究者提供了一個可靠且經(jīng)濟高效的甲基化分析平臺。850K芯片可檢測人全基因組約853,307個CpG位點的甲基化狀態(tài)，其中包含了原450K芯片91%的位點，并增加了413,745個位點（圖 1）。850K芯片不但保持了對CpG島，基因啟動子區(qū)的全面覆蓋，還特別加強了增強子區(qū)（新增了333,265個探針覆蓋來自ENCODE及FANTOM5計劃的增強子）以及基因編碼區(qū)的探針覆蓋。廣泛應(yīng)用于干細胞研究、腫瘤和其他復(fù)雜疾病研究，是目前非常適合表觀基因組全關(guān)聯(lián)分析研究的全基因組DNA甲基化芯片。
芯片特點：
- 覆蓋全面：檢測853,307個CpG位點；全面覆蓋CpG島、啟動子、編碼區(qū)及增強子。
- 無需“甲基化DNA免疫共沉淀”，亞硫酸氫鹽處理基因組DNA即可進行芯片實驗； Infinium探針設(shè)計，直接識別甲基化位點；
- 技術(shù)重復(fù)重現(xiàn)率>98%；
- 操作簡單，無須PCR擴增；模板量可低至250ng；
- 適用于FFPE樣品。
Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片對全基因組的全覆蓋
? ? ??850K芯片對基因組的功能元件提供了空前全面覆蓋：CpG島、RefSeq基因、ENCODE開放染色質(zhì)、ENCODE轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)以及FANTOM5增強子。**的Infinium HD技術(shù)的保證了目標區(qū)域超高密度覆蓋，同時還避免了甲基化DNA捕獲方法具有偏向性的缺點。850K芯片的一大特點是增加了很多由ENCODE項目中鑒定出來的潛在增強子。（ENCODE通過全面分析開放染色質(zhì)、FAIRE實驗、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，整合出基因組中活躍的區(qū)域。）最后，芯片還覆蓋了FANTOM5項目鑒定得到的不同組織類型中的增強子。下圖及表格統(tǒng)計展示了850K芯片對于不同染色體、基因組功能元件的覆蓋及分布。以上的設(shè)計不但可從泛-增強子及編碼區(qū)域角度分析甲基化組，還在全基因組表觀遺傳關(guān)聯(lián)研究（EWAS）中發(fā)揮重要作用。850K芯片中所包含的系列有價值的位點：
- CpG島以外的CpG位點
- 人類肝細胞中的非CpG甲基化位點（CHH位點）
- 腫瘤（多種類型的癌癥）VS正常樣本中的不同甲基化位點，可以檢測多種樣本類型
- FANTOM5增強子
- ENCODE開放染色質(zhì)和增強子
- 脫氧核糖核酸酶超敏位點
- miRNA啟動子區(qū)域
- 涵蓋Infinium Methylation 450 BeadChip芯片中的＞90%的內(nèi)容
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芯片數(shù)據(jù)的可靠性
? ? ??Methylation EPIC BeadChip沿用了在450K芯片中取得成功的Infinium I及II探針設(shè)計（Figure 4）,以達到保證數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠的同時也達到對目標區(qū)域全面覆蓋。Infinium II探針對目的CpG位點采用單個探針且序列中包含簡并堿基設(shè)計，即使序列中有多達三個CpG位點的甲基化狀態(tài)影響也不會對目的位點的結(jié)果造成影響。Illumina的科學(xué)家嚴格檢測每個產(chǎn)品，以確保強大而重復(fù)的性能，讓研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)行業(yè)**的數(shù)據(jù)質(zhì)量。
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（1）Infinium Ⅰ 探針設(shè)計
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（2）Infinium Ⅱ 探針設(shè)計
? ? ??Infinium Ⅱ 探針只使用一種磁珠，探針末端為C，與目的位點的前一個堿基配對，只延伸一個堿基（ ddNTP-BioT， ddNTP-DNP）分別與非甲基化或甲基化位點配對。根據(jù)兩種熒光類型及計算目的位點的甲基化程度。
基于Infinium平臺的可靠性，850K芯片表現(xiàn)出非常完美的重復(fù)相關(guān)系數(shù)（r2＞0.98），而且850K芯片與450K芯片相同的位點的重復(fù)r2＞0.98，為850K與450K數(shù)據(jù)的整合分析建立了基礎(chǔ)。此外通過比較8個生物學(xué)樣品的重復(fù)的結(jié)果，850K芯片能可靠檢測0.2的delta-beta值，且假陽性率低于1%。此外，芯片中設(shè)計了樣品依賴和樣品不依賴的內(nèi)參以保證數(shù)據(jù)的高質(zhì)量，例如專為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后而復(fù)雜度降低序列而設(shè)計的陰性對照。
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850K芯片適用于FFPE樣品的甲基化研究
? ? ??Illumina為FFPE樣本的檢測改進了protocol，以獲得更可靠成穩(wěn)定的結(jié)果。通過與新鮮樣本的比較，可見雖然FFPE樣本的檢出率受到樣本質(zhì)量的影響而下降，但FFPE樣本的技術(shù)重復(fù)的相關(guān)性R平方仍然高達0.98。對同一份樣本的冰凍樣本及FFPE樣本的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)兩者相關(guān)依然很高（R=0.994）。
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三、樣本要求：
樣品類型：組織、細胞、基因組DNA
- 樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.7～2.0 之間；RNA 應(yīng)該去除干凈；不得有其它個體或其它物種的DNA污染。
- 樣品濃度：濃度不低于50ng/μl；
- 樣品總量：每個樣品總量不少于2μg 。
- 樣品溶劑：溶解在TE中。
- 樣品運輸： DNA低溫運輸（-20℃）；在運輸過程中請用parafilm將管口密封好，以防出現(xiàn)污染。
四、數(shù)據(jù)分析
? ? ? ?詳細內(nèi)容同450K數(shù)據(jù)分析內(nèi)容，詳見鏈接：http://www.shbio.cn/product/30.html
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Agilent DNA甲基化芯片服務(wù)
Agilent DNA甲基化芯片服務(wù)
Agilent 的甲基化芯片通過SurePrint芯片合成**技術(shù)，優(yōu)化探針設(shè)計及實驗方法，可靈活進行甲基化研究，得到高靈敏度、高特異性、高重復(fù)性的結(jié)果。
芯片推薦：Agilent Human CpG Island Microaray 1x244K
芯片介紹：覆蓋27,800個人類CpG島，參考數(shù)據(jù)庫為：UCSC hg18 (NCBI Build 36.1, March 2006)。
芯片推薦：Agilent Human DNA Methylation Microarray 1x244K
芯片介紹：覆蓋27,627個人類CpG島和5081個UMR區(qū)域，參考數(shù)據(jù)庫為：UCSC hg18 (NCBI Build 36.1, March 2006)。
芯片推薦：Agilent Mouse CpG Island Microarray, 2x105K
芯片介紹：覆蓋16,030個小鼠CpG島，參考數(shù)據(jù)庫為：UCSC mm8 (NCBI Build 36, February 2006)。
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Shbio DNA甲基化芯片服務(wù)
Shbio DNA甲基化芯片服務(wù)
芯片推薦：SBC 人類全基因組CpG 島芯片服務(wù)
芯片介紹：本甲基化芯片針對基因組中所有的GC%>57%，長度>250bp的46957個CpG島而設(shè)計，覆蓋全基因組中的CpG島。甲基化芯片由本公司自行開發(fā)設(shè)計，Nimblegen公司合成，包括兩有套設(shè)計方案：探針位于CpG島內(nèi)或位于島外，每張芯片上總共含有392778個探針。具有覆蓋率廣、敏感度高、精確度高的特點。 芯片通過特異性結(jié)合甲基化DNA的蛋白-MBD2b，富集基因組中的甲基化DN**段，再通過接頭放大標記后進行芯片分析。
BSP &MSP服務(wù)
BSP服務(wù)針對少數(shù)的已知基因或位點設(shè)計，根據(jù)亞硫酸氫鈉處理后甲基化的胞嘧啶C不變，而普通胞嘧啶變成U的原理，設(shè)計引物擴增經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后的樣品，通過判斷PCR是否能擴增或通過測序確定目的片段中的CpG位點的甲基化狀態(tài)。
MSP服務(wù)原理與BSP類似，通過甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶切割與PCR相聯(lián)，研究酶切位點的甲基化狀態(tài)。
BSP Microarray服務(wù)
通過亞硫酸氫鈉處理后甲基化的胞嘧啶C不變，而普通胞嘧啶變成U的原理，對目的片段內(nèi)的各位點設(shè)計相應(yīng)的探針，檢測其甲基化狀態(tài)。適于研究中大量樣本的目的片段，具有方便快捷，靈敏度高的優(yōu)點。