在2.46億糖尿病患者中，大約三分之一有糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)的跡象。DR的發病機制非常復雜，尚未完全闡明，其基本病理變化是血視網膜屏障(blood retina barrier, BRB)的破壞和視網膜新生血管的形成。

由于參與視網膜炎癥反應的細胞數量眾多，細胞之間的調節機制復雜，血視網膜內屏障(inner BRB, iBRB)在DR早期損傷的機制尚不完全清楚，其探索仍然是一個重大挑戰。

scRNA-seq，免疫熒光

（部分技術服務由伯豪生物提供）

本研究主要使用了單細胞轉錄組測序技術(scRNA-seq)，使用了5個大鼠視網膜樣本（2只正常SD大鼠；3只DR大鼠，在造模2周、4周和8周各1只），總共檢測35,910個轉錄本，探討了DR早期iBRB損傷的細胞機制。

本文探索了周細胞、內皮細胞和兩種繆勒氏細胞亞型的特征，并在DR早期構建了它們之間的調控網絡。研究結果再次強調了iBRB的重要作用，為保護iBRB和抑制DR的進一步發展提供了有潛力新的靶點，具有深遠的臨床意義和社會價值。

1. 血液-視網膜內屏障(iBRB)中細胞類型圖譜

為了模擬早期DR，實驗使用鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)在大鼠中構建2型糖尿病模型。實驗剝離了5只大鼠的視網膜(2只正常大鼠；3只用STZ處理大鼠，每只分別處理2周、4周和8周)，對組織進行解離稀釋并進行單細胞轉錄組測序。質控過濾后，保留了35,910個高質量細胞：11,073個來自正常樣本；24,837個來自糖尿病大鼠樣本。將聚類分群的33個cluster分為10種細胞類型，可概括為兩大類別包括：血液來源的巨噬細胞類群和視網膜駐留細胞類群。其中視網膜駐留細胞包括神經元細胞(棒細胞、錐細胞、視網膜水平細胞、無長突細胞和雙極細胞)、膠質細胞(繆勒氏細胞和小膠質細胞)、內皮細胞和周細胞?；贑ellChat分析，發現內皮細胞、周細胞和繆勒氏細胞比其他細胞具有更復雜的通信模式。此外，本文計數了正常大鼠和糖尿病大鼠中不同細胞群差異表達基因數量(differentially expressed genes, DEGs)，結果顯示構成iBRB的細胞：繆勒氏細胞、內皮細胞和周細胞在DR早期發生顯著改變。GO富集分析顯示，這三種細胞類型都與血管的形成和增殖、缺氧和細胞粘附有關。周細胞顯示與血管收縮相關，而繆勒氏細胞與神經元的形成和發育有關。

2. 繆勒氏細胞兩種亞型的特征

在DR的早期，繆勒氏細胞損傷可導致視網膜穩態的破壞。根據前面的標志物(Apoe, Glul, Clu)，進一步細分兩組繆勒氏細胞亞群，并命名為Ctxn3⁺繆勒氏細胞和Ctxn3^-繆勒氏細胞。利用免疫熒光驗證兩個亞群在組織的存在，但由于結果的模糊性，后續還需要進一步進行更多的實驗。通過前期的文獻調研發現，γ-氨基丁酸（GABA）轉運蛋白，細胞膜上的谷氨酸轉運蛋白，胞內谷氨酰胺合成酶，這些均消除谷氨酸積累，減少其引起的細胞毒性。而這兩組亞群中Ctxn3⁺繆勒氏細胞呈現比較強的GABA轉運代謝的功能。Ctxn3⁺繆勒氏細胞同時還特異性高表達血管粘附因子(vascular adhesion molecule, VCAM1)，還能釋放炎癥因子如：IL33。這些都表明Ctxn3⁺繆勒氏細胞和視網膜的炎癥反應相關性更強。通過SCENIC分析，結合轉錄因子進一步分析Ctxn3⁺繆勒氏細胞在疾病中的作用。結果顯示兩類轉錄因子在Ctxn3⁺繆勒氏細胞中主要上調；(1) AP-1家族成員，如：Jun、Fos和Jund；(2) SOX家族成員，如：Sox2和Sox9。UMAP圖顯示了重要轉錄因子下游靶基因的表達情況。通過網絡圖，我們發現AP-1家族可以調節Id蛋白(DNA結合/分化抑制蛋白)的變化。

3. 內皮細胞和周細胞的特性及其相互關系

血小板衍生生長因子受體β(Platelet-derived growth factor receptor beta, pdgfrβ)在血管壁細胞的發育中發揮重要作用(包括周細胞和血管平滑肌細胞)。結果顯示pdgfrβ在cluster 20和cluster 27中高表達。因此，將這兩個細胞群進一步定義為周細胞的亞群，分別命名為周細胞A亞群和周細胞B亞群。通過分析血管內皮細胞的特征，發現了一系列有潛力的新靶點。KEGG分析顯示，周細胞A亞群和周細胞B亞群均表現血管平滑肌收縮功能增強，該功能與周細胞局部調節微血管血流的特征相關。隨后分析比較了兩組周細胞基因集變異分析(GSVA)，結果顯示周細胞A亞群具有增加的ECM受體相互作用和其他途徑，而周細胞B亞群富集血管平滑肌收縮和肌動蛋白細胞骨架調節等途徑。

4. 繆勒氏細胞和iBRB的通訊網絡

為了揭示早期DR中iBRB損傷的潛在機制，本文深入研究了繆勒氏細胞、內皮細胞和周細胞之間的復雜通訊。使用CellChat分析，我們發現繆勒氏細胞通過分泌因子在iBRB的調節中發揮著潛在作用。研究表明，Vegf/Vegfr2信號通路最有可能影響生物合成、分泌，也參與到繆勒氏細胞腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)和膠質細胞源性神經生長因子(glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF)降解過程，從而促進繆勒氏細胞的存活并具有神經保護作用。此外，兩組繆勒氏細胞均分泌胰島素樣生長因子2 (Igf2)，該因子作用于周細胞B亞群上的受體Igf2r，調節其增殖分化和存活。血管生成素樣蛋白4(Angiopoietin-like protein 4, Angptl4)由內皮細胞分泌，不僅作用于繆勒氏細胞和周細胞，還影響自身。內皮細胞通過Angptl4-Cdh11/Sdc4/Sdc2對繆勒氏細胞和周細胞具有一定的調節作用，但其具體功能值得進一步研究。