焦磷酸測序技術(shù)（Pyrosequencing）是針對序列的檢測技術(shù)，能夠快速精確地對序列變異進(jìn)行定量。簡化的操作步驟、分析的靈活性和理想的輸出數(shù)據(jù)使焦磷酸測序技術(shù)為大通量、低成本、直觀地進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNPs）研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術(shù)操作平臺。

焦磷酸測序原理

步驟1

擴(kuò)增DN**段并對焦磷酸模板鏈進(jìn)行生物素化。通過變性，分離生物素化的單鏈PCR擴(kuò)增子并使其與一條測序引物進(jìn)行雜交。

步驟2

將雜交引物和單鏈模板與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和腺苷三磷酸雙磷酸酶，以及底物腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和熒光素共孵育。

步驟3

第一個脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）被引入反應(yīng)。DNA聚合酶催化dNTP，使其在互補(bǔ)模板鏈的情況下對測序引物進(jìn)行延伸。每個核苷酸的添加都對應(yīng)著等摩爾數(shù)焦磷酸（PPi）的釋放。

步驟4

ATP硫酸化酶在腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）存在的情況下將PPi轉(zhuǎn)化為ATP。生成的ATP為熒光素酶介導(dǎo)的熒光素氧化反應(yīng)提供能量，并生成與ATP的數(shù)量成比例的可見光。電荷耦合器（CCD）攝像頭檢測到熒光素酶催化反應(yīng)所生成的光，并將其作為原始輸出數(shù)據(jù)中的一個峰值（熱解圖Pyrogram）。每個峰值（光信號）的高度與核苷酸結(jié)合的數(shù)目呈比例關(guān)系。

步驟5

腺苷三磷酸雙磷酸酶是核苷酸的降解酶，持續(xù)地對未結(jié)合的核苷酸和ATP進(jìn)行分解。當(dāng)分解完成時，便會引入另一個核苷酸。

步驟6
dNTP的添加反應(yīng)在持續(xù)進(jìn)行著。應(yīng)注意脫氧腺苷三磷酸α-硫代三磷酸（dATPαS）能夠作者為天然脫氧腺苷三磷酸（dATP）的替代物，被DNA聚合酶有效利用，卻并不會被熒光素酶所識別。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時，逐漸合成了互補(bǔ)的DNA鏈，其核苷酸序列能夠憑借熱解圖（Pyrogram）軌跡中的信號峰值來確定。

強(qiáng)大的PyroMark平臺與表觀遺傳和遺傳分析流程無縫接合，一次檢測可多達(dá)96個樣本。可檢測病原體中藥物抗性的發(fā)展，基因表達(dá)調(diào)控中表觀遺傳學(xué)DNA甲基化的作用、牲畜的特異表型的遺傳標(biāo)記，以及法醫(yī)檢材樣本中線粒體DNA的多態(tài)性。其與QIAGEN先進(jìn)的樣本制備、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和PCR擴(kuò)增技術(shù)兼容。借助于高度可靠的儀器可在序列水平上對SNP、插入和缺失、CpG位點進(jìn)行檢測以及生成序列信息，簡化的工作流程可更快速地獲得結(jié)果。

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