當細胞達到匯合80-90%時，必須對其進行傳代培養或傳代。未能傳代培養匯合細胞會導致有絲分裂指數降低并最終導致細胞死亡。傳代培養的第一步是通過胰蛋白酶消化或機械手段將細胞從原代培養容器表面分離。小伙伴們在給貼壁細胞傳代的時候有沒有遇到細胞消化不下來的情況呢？有時候等了10分鐘甚至20分鐘細胞仍不動，繼續等待怕消化過度，暴力吹下又怕對細胞造成機械損傷，可謂進退兩難。我們先來了解下消化的作用機制：

一、 消化作用的分子基礎‌

1.胰酶的核心作用機制‌

胰蛋白酶作為絲氨酸蛋白酶，特異性切割精氨酸和賴氨酸的羧基端肽鍵，通過水解作用破壞以下關鍵結構：

細胞外基質（ECM）‌：降解纖連蛋白、層粘連蛋白等貼附支架蛋白；

細胞間連接蛋白‌：切割鈣黏蛋白和整合素，解除細胞-基質及細胞-細胞間的黏附。

輔助試劑EDTA通過螯合Ca²?/Mg²?離子，削弱整合素與ECM的結合，提升胰酶效率。

2.離子螯合劑的協同效應‌

0.02% EDTA通過剝奪細胞表面依賴鈣/鎂離子的黏附蛋白（如橋粒、鈣黏著蛋白），使細胞連接失活而不損傷膜蛋白結構，適用于表面分子檢測實驗。

‌二、消化過程的分階段動態變化‌

1.初始裂解階段‌

胰酶滲透細胞層，切割ECM蛋白，細胞邊緣開始卷曲，貼附力下降；

2.連接破壞階段‌

鈣黏蛋白降解導致細胞間連接松開，單層細胞分裂為小片狀；

3.完全脫落階段‌

細胞形態由鋪展轉為圓形，最終脫離培養表面（需37℃恒溫加速反應）。

‌三、終止反應的生化原理‌

血清終止法‌：含血清培養基中的α-1抗胰蛋白酶可不可逆抑制胰酶活性；

‌清洗終止法‌：PBS沖洗去除殘留胰酶，避免過度消化損傷細胞膜受體。

以下總結了細胞難消化的原因，以及對應的處理方式：

1.細胞貼壁緊

不同種類的細胞貼壁的松緊程度是不一樣的，比如293系列細胞貼壁很松，是晃一晃就可能掉下來的程度。而MCF10A、IBMDM等巨噬細胞系貼壁很緊，可能需要消化5-10min甚至更久才能脫落。在培養一株細胞之前，可以問問有經驗的科研人員或者上網查資料或者從細胞來源處確認這株細胞大概消化多久，才能更好完成消化步驟使細胞保持最佳狀態。

還有不規則形態細胞存在更多貼附位點，需增加胰酶用量至完全覆蓋細胞層才能達到消化的目的。如：

解決方案：若您培養的細胞貼壁較緊，參考以下步驟1.增加消化時間，常規細胞消化時間為1-3min，難消化的細胞需要5-15min甚至更長。 2.提高胰酶的濃度，常用濃度為0.25%，可提高到0.5%；3.加入足量的胰酶至沒過細胞，37℃消化；使用含有EDTA的胰酶，具體請以鏡下觀察到細胞變圓脫落為準。（常用的培養器皿推薦胰酶添加量）

小技巧：在消化貼壁較緊的細胞有個小技巧，就是消化到細胞要脫落的時候先不終止，先吸胰酶輕輕吹下細胞，大部分細胞脫落后再加終止液。貼壁太強的細胞，先加終止有時候會很快貼壁回去導致消化其實細胞已經要脫落了，但一加終止液就貼回去的情況。

注:如還有部分細胞未消化下來，可采用分步消化:

① 準備一個無菌的 15ml 離心管，加入 2ml含 10%FBS 的完全培養基;

② 將消化下來的細胞吸入①中的離心管內中和(避免吹打);

③ 向之前消化的培養瓶中加入 1ml 胰酶繼續消化 2min 左右，輕拍培養瓶，95%左右細胞脫落后加入 2ml含 10%FBS 的完全培養基中和，中和后的細胞懸液移入①中的離心管內。

比如：bEnd.3細胞培養時間越長越難消化，培養4d傳代，一般消化3~5 min；培養7d傳代，一般消化5~10 min。具體消化時間以顯微鏡下觀察細胞狀態為準。

2.有殘留血清

　　血清中的某些蛋白質（如α1-抗胰蛋白酶，α2-巨球蛋白）對蛋白酶有強烈的抑制作用。如果PBS清洗不徹底，胰酶將不能發揮作用。

　　解決方案：若在消化途中發現因清洗不徹底而無法消化下來，吸去培養器皿中的胰酶（如果已有部分細胞脫落，將已脫落細胞轉移至離心管），向培養器皿中加入足量PBS重新潤洗30s，棄去PBS再加入新的胰酶來重新消化。

3.胰酶量過少/濃度低/消化溫度低

　　有的小伙伴習慣用胰酶清洗細胞后去掉大部分胰酶，用剩余的胰酶繼續消化，這對于貼壁松的細胞是可以的，但該方法并不適用于貼壁緊的細胞。胰酶量太少無法將貼壁緊的細胞消化徹底。胰酶的最適溫度是37℃，有一種常用策略是室溫消化，當溫度低于37℃時胰酶活性低，室溫環境消化還可以放在顯微鏡下邊看邊消化，更容易把握消化進度。但仍然需要注意這適用于貼壁較松且比較脆弱的細胞，對于貼壁緊的細胞室溫下是很難消化下來的，甚至可能因消化時間過長對細胞產生傷害。常見的胰酶濃度有0.125%，0.25%和0.5%。常規細胞系多用0.25%胰酶，而對胰酶敏感的較脆弱的細胞可使用0.125%胰酶消化。應根據細胞的貼壁特性和胰酶耐受程度，使用不同濃度的胰酶。

　　解決方案：根據細胞貼壁特性選擇合適的胰酶使用量、濃度和消化溫度。

4.胰酶失活

　　胰酶開封久了活性會降低甚至徹底失活，所以小伙伴們可以根據需要將開封的胰酶分裝到離心管中，將暫時不用的部分放在-20℃冰箱冷凍，放在2-8℃冷藏的胰酶也要盡早使用完畢哦。

　　解決方案：若發現胰酶開封太久，建議使用新的胰酶進行消化。

5.胰酶品牌差異

　　胰酶通常來自?；蜇i的胰腺，不同廠家的提取加工工藝不同，所生產的胰酶消化時間差別較大。

　　解決方案：從不同廠家獲取胰酶試用裝，找到最適合自己細胞的胰酶品牌。

6.細胞密度過大或長時間不傳代

　　細胞密度過大，造成細胞擁擠或者堆疊時細胞將變得更難消化。另外，細胞長時間培養不傳代也有可能使細胞貼壁變緊。

解決方案：若出現上述情況，可增加胰酶的用量，并適當延長消化時間，直到細胞能夠脫落。

7. 增加胰酶的用量，延長消化時間，用常規方法細胞仍消化不下來，如何處理？

解決方案：若出現上述情況，先判斷細胞消化前的狀態是否正常，若細胞形態異常，出現老化或分化現象，貼壁就會異常牢固，用常規方法消化不下來。可嘗試用刮刀將細胞刮下來，離心傳代后觀察細胞狀態，若細胞形態狀態仍異常，建議丟棄，重新復蘇其他批次。