中喬新舟助力相關成果發表

恩扎魯胺耐藥是去勢抵抗型前列腺癌預后不良的重要原因，盡管已知 KDM5B 在耐恩扎魯胺的去勢抵抗型前列腺癌中高表達，但其介導耐藥的具體機制尚不明確。本研究采用單細胞與多組學生物信息學分析結合體外、體內實驗驗證，并運用乳?；鞍踪|組學、CRISPR/Cas9、ChIP 及雙熒光素酶報告實驗等技術開展機制探究。結果顯示，KDM5B 可通過表觀遺傳抑制 PTEN，激活 PI3K/Akt 通路，上調 PGK1 并引發代謝重編程與乳酸生成，進而誘導恩扎魯胺耐藥；乳酸可作為底物經 p300 介導 hnRNPA1 第 179 位賴氨酸乳?；?，阻斷其 NEDD4L 介導的泛素化以穩定蛋白，促進 AR-V7 剪接，同時 KDM5B 與 AR 之間還形成正反饋環路進一步增強耐藥。體內實驗證實，抑制 KDM5B 或 p300 可逆轉恩扎魯胺耐藥。本研究揭示了連接代謝、表觀遺傳與 KDM5B/AR 反饋環路的耐藥新機制，提示多靶點干預有望成為克服去勢抵抗型前列腺癌恩扎魯胺耐藥的有效策略。

我們榮幸地向長期使用中喬新舟無血清培養基的合作伙伴致以熱烈祝賀
由重慶醫科大學研究團隊完成的成果《KDM5B-driven glucose metabolic reprogramming promotes enzalutamide resistance in prostate cancer via the lactate/hnRNPA1 lactylation/AR-V7 axis》發表于國際知名期刊《Molecular Cancer》(IF=33.9)。在該研究中，作者團隊選用了中喬新舟提供的RWPE-1人正常前列腺上皮細胞專用培養基（貨號：ZM0351），用于關鍵細胞模型的培養。
該研究確定了一種機制，將代謝、表觀遺傳學和KDM5B/AR反饋環與耐藥性聯系起來。這些發現表明，多靶點策略可能是克服CRPC中Enza耐藥性的有希望的方法。

一、研究背景與科學問題

前列腺癌（PCa）仍然是全世界男性癌癥相關死亡的主要原因之一。其發病率在不同地區有顯著差異。雄激素受體信號抑制劑（ARSIs），如恩扎魯胺（Enza），是晚期PCa的主要治療方法。這些藥物通過阻斷雄激素受體（AR）信號來抑制腫瘤生長。然而，大多數患者最終發展為去勢抵抗型前列腺癌（CRPC）對ARSIs的抗性涉及復雜的機制，其中一個關鍵因素是組成性活性雄激素受體剪接變異體（AR-Vs）的發展。最著名的變體AR-V7缺乏Enza所針對的配體結合域（LBD）。這種缺失使 AR-V7 持續活躍，即使在強效 ARSI 存在的情況下，也能促進親腫瘤的轉錄程序。雖然AR-V7的下游效應已被充分描述，但控制其剪接的上游調控網絡尚未完全了解。

二、核心優勢

本研究結合“多組學分析和臨床前模型及臨床隊列“的功能驗證，識別出Enza耐藥性的新機制。證明KDM5B通過表觀遺傳抑制PTEN激活PI3K/Akt通路。這導致糖酵解酶磷酸甘油激酶1（PGK1）上調，促進代謝重編程和乳酸積累。乳酸增加后，作為p300介導的裂接因子hnRNPA1在賴氨酸179處乳化的底物。HDAC1/2可以可逆地去除這種修改。乳酸化的hnRNPA1（K179la）保持穩定，因為它避免了NEDD4L介導的泛素化和降解。該改裝提升了主動AR-V7接頭變體的生產效率，這是抵抗力的關鍵因素。研究團隊還發現了一個潛在的反饋環路，即KDM5B驅動的Akt信號促進AR激活，而AR隨后增加KDM5B轉錄。這個環路有助于維持阻力。發現表明針對KDM5B介導軸的多靶點干預可能成為克服Enza耐藥性的有前景策略。

三、實驗方法與主要結果

1. 在高乳酸化代謝的EnzR PCa亞群中識別KDM5B

為了探討Enza抗性的異質性，首先團隊分析了親本細胞和EnzR LNCaP細胞的scRNA-seq數據，識別出16個不同的細胞簇。通過根據細胞的耐藥狀態和LRG活性進行分類，確定了四個主要亞組：敏感高乳化（SH）、敏感低乳化（SL）、耐藥高乳化（RH）和耐藥低乳化（RL）?；蚪M變異分析（GSVA）顯示RH簇在糖酵解和耐藥相關通路方面顯著富集，而CellChat分析顯示該簇擁有最活躍的細胞間通信網絡，在原腫瘤誘導信號（如膠原蛋白）中發揮關鍵作用。

圖1：在高乳酸化代謝的EnzR PCa亞群中識別KDM5B

50. A示意圖，說明單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析的工作流程。
50. B圖均勻流形近似與投影（UMAP）圖，顯示了從scRNA-seq數據集中識別出的16個不同細胞簇。
50. C細胞群體的分層。細胞按樣本來源分類（右上角為Enza敏感型與抗性型）及由“AUCell”算法推導出的乳酸相關基因（LRG）特征評分（左上角）。
50. Enza敏感和抗性樣品之間的差異表達基因（DEGs）的火山圖GSE104935數據集（|logFC| < 0.5，p< 0.05）.

2. KDM5B通過上調PGK1重新編程葡萄糖代謝，并賦予Enza耐藥性

基于我們的scRNA-seq分析，顯示KDM5B+耐藥細胞中糖酵解通路富集。結合我們之前的數據，顯示KDM5B表達與全局Pan-Kla水平呈正相關。為了驗證這一點，我們首先確認了抗藥細胞的代謝表型。事實上，EnzR細胞表現出高糖解狀態，其特征是糖PER和ECAR相較于其敏感細胞更高。重要的是，這種糖解重編程與KDM5B的表達密切相關。這一點通過在EnzR細胞中敲低KDM5B得以證實，降低了其糖解能力、葡萄糖攝取和乳酸的產生。相反，EnzS細胞中的異位KDM5B過度表達足以增加這些糖酵解指標。因此，這些數據表明，在Enza抗性細胞中觀察到的葡萄糖代謝重編程可能由KDM5B驅動。

圖2：KDM5B通過上調PGK1重新編程葡萄糖代謝，并賦予恩扎耐藥性

50. 海馬XF代謝通量分析。比較Enza敏感（EnzS）和抗性（EnzR）LNCaP細胞（A）在KDM5B敲低后（B）及親本細胞KDM5B過表達（C）后，在EnzR細胞中的糖解質子外流速率（GlycoPER）、細胞外酸化速率（ECAR）和氧氣消耗速率（OCR）。
50. 使用熒光葡萄糖類似物2-NBDG進行葡萄糖攝取測定。定量KDM5B敲低EnzR細胞（D）和KDM5B過度表達的親本細胞（E）中的葡萄糖攝取。
50. KDM5B 敲除 EnzR 細胞（左）和 KDM5B 過表達親代細胞（右）的乳酸產生測定。

3. KDM5B通過表觀遺傳機制抑制PTEN，激活PI3K/Akt通路，推動糖酵解，并促進對恩扎魯胺的耐藥性

為研究KDM5B調控的下游通路，我們分析了來自KDM5B過表達RNA-seq數據集中的差異表達基因（DEGs）。從功能上講，DEGs指向兩個主要的生物學主題。首先，如預期，與KDM5B核心酶功能相關的Go術語，如“組蛋白賴氨酸脫甲基化”和“組蛋白脫甲基化”，被富集。其次，且更具機制性的是，KEGG通路分析發現了“糖酵解/糖新生”和“PI3K-Akt信號通路”的富集。這一發現與scRNA-seq分析一致，后者還顯示KDM5B+耐藥細胞中PI3K-Akt通路富集。

圖3：KDM5B通過表觀遺傳機制抑制PTEN激活PI3K/Akt通路，驅動糖酵解，并促進對enzalutamide的耐藥性

50. RNA-seq數據的基因本體（GO）和KEGG功能通路。
50. Western blot 分析顯示，KDM5B 的敲低會增加 EnzR 細胞（C）中的 PTEN 并降低 p-Akt 水平，而 KDM5B 過表達則在親本細胞（D）中產生相反效果。H3K4me3水平被標為KDM5B脫甲基化酶活性的對照。
50. 免疫熒光染色顯示，在不同治療條件下，異種移植腫瘤中Akt（綠色）和p-Akt（紅色）均定位。圖像通過共聚焦激光掃描顯微鏡（比例：20微米）拍攝。

4. hnRNPA1-K179的乳化驅動AR-V7剪接，并賦予PCa中的Enza抗性

鑒于KDM5B促進糖酵解，我們首先試圖將這一代謝性狀與下游信號傳導聯系起來。TCGA-PRAD數據集的GSEA顯示，高KDM5B表達組中“通過切合體進行替代mRNA剪接”通路富集（ES = 0.6876，NP = 0.0000）。這促使我們假設KDM5B驅動的乳酸積累可能影響AR切割，從而產生抗性相關變異體AR-V7。支持這一觀點的是，在我們的小鼠CDX模型中，KDM5B敲低細胞的腫瘤組織乳酸水平較低。當腫瘤組織接受乳酸處理時，AR-V7 mRNA水平隨時間和劑量變化增加，確立乳酸與AR-V7表達之間的直接聯系。

圖4：hnRNPA1-K179的乳酸化驅動AR-V7剪接，并賦予PCa中的Enza抗性

50. 基因集富集分析（GSEA）顯示，TCGA-PRAD數據庫中KDM5B高表達組中“通過切合體進行替代mRNA剪接”通路的富集。
50. CDX模型示意圖（左）及不同干預組切除腫瘤乳酸水平的定量（右，n=5）（使用Biorender平臺繪制）。
50. RT-qPCR分析表明，乳酸處理會以劑量（左）和時間依賴（右）方式提高異種移植組織中的AR-V7 mRNA水平。
50. CDXEnzR和CDX親本組織乳酸化組學分析示意圖（使用Biorender平臺繪制）。

5. K179的乳化通過抑制hnRNPA1的NEDD4L介導泛素化和蛋白酶體降解來穩定其蛋白酶體

我們研究了hnRNPA1乳糖化如何改善AR-V7剪接。由于蛋白質穩定性會影響剪接因子活性，我們首先進行了環己酰胺（CHX）追蹤測定。結果顯示，非乳?；腒179R突變體穩定性低于野生型（WT）hnRNPA1。此外，乳酸處理提高了WT hnRNPA1的穩定性，但未影響K179R突變體，表明K179乳?；茉鰪奾nRNPA1的穩定性。由于蛋白質穩定性通常受泛素化控制，我們測量了hnRNPA1泛素化水平。我們觀察到EnzR細胞中的泛素化減少。與此一致的是，抑制糖酵解作用會增加hnRNPA1泛素化，而乳酸處理則產生相反效果

圖5.K179的乳酸化通過抑制hnRNPA1的NEDD4L介導泛素化和蛋白酶體降解來穩定其蛋白酶體

50. 蛋白質穩定性分析。用WT或K179R突變hnRNPA1重構的hnRNPA1-KO EnzR細胞，使用蛋白質合成抑制劑環己酰亞胺（CHX）（40微分）處理，可加乳酸或無乳酸（20微分）。西方印跡（A）和hnRNPA1半衰期（B）定量顯示乳酸穩定WT，但不穩定K179R hnRNPA1。
50. 體內泛素化檢測。Flag-hnRNPA1的泛素化在EnzR細胞中低于親本細胞（C）。乳酸處理（20uM）減少，而氧酸鈉（20uM）增加，hnRNPA1泛素化（D）。

6. KDM5B與配體非依賴AR信號之間的潛在正反饋環路驅動Enza電阻

鑒于ENZA抗性PCa細胞中KDM5B表達升高，且AR在此過程中扮演重要角色，我們旨在利用TCGA-PRAD數據庫中的RNA-seq譜分析KDM5B與AR之間的關系。GSEA顯示KDM5B高表達組的“雄激素反應”通路顯著富集，并且觀察到KDM5B與AR mRNA水平之間存在強正相關。這一相關性進一步得到了我們的發現支持，即AR陽性PCa細胞系（LNCaP，C4-2）表達的KDM5B水平高于AR陰性系（DU-145，PC-3）。為了探討潛在的直接調控關系，我們調節了AR活性。敲低AR會降低KDM5B表達，而AR過度表達則有相反效果。此外，通過AR配體二氫睪酮（DHT）刺激AR活性，或通過慢病毒遞送增加AR蛋白水平，均導致KDM5B表達的劑量依賴性增加。

圖6.KDM5B與配體非依賴的AR信號之間的正反饋環路驅動了Enza的抵抗

50. GSEA顯示TCGA-PRAD數據庫中KDM5B高表達組“雄激素反應”通路富集。
50. TCGA-PRAD隊列（B）及多種前列腺細胞系（C）中KDM5B與AR mRNA表達的相關分析。
50. 西方墨跡（D）和RT-qPCR（E）分析顯示，AR敲低會降低KDM5B表達。

四、總結

本文研究揭示了一種新的藥物耐藥機制：KDM5B通過表觀遺傳沉默PTEN激活PI3K/Akt信號通路，進而上調PGK1，重編程腫瘤細胞中的葡萄糖代謝并促進乳酸積累。乳酸通過P300介導的hnRNPA1乳酸化增強AR-V7的表達。值得注意的是，還有一種閉環機制，涉及“KDM5B-PTEN/PI3K/Akt-AR-KDM5B”。本研究為糖酵解產生的乳酸在PCa中Enza耐藥性提供了新視角。它不僅擴展了復雜的代謝、表觀遺傳和耐藥網絡，還提出了多靶點聯合干預的潛在治療策略，以逆轉PCa中的Enza耐藥性。

五、關于中喬新舟

本研究中RWPE-1細胞使用了RWPE-1人正常前列腺上皮細胞專用培養基（貨號：ZM0351）進行培養，印證了高端科研對專用試劑產品的要求。
中喬新舟提供品種豐富的細胞培養基產品，主要分為基礎培養基，細胞系完全培養基，動物原代細胞完全培養基，人原代細胞完全培養基，永生化細胞完全培養基等。該系列產品均由公司技術研發團隊歷經數年精心設計優化，可保持細胞良好的生長狀態。所有產品均有通過嚴格的質控體系，經過微生物檢測、PH值檢測、細跑生長驗證實驗等確保了培養基質量的穩定性。
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