頂刊高光?輝煌里程碑

中喬新舟助力成果榮登國際頂刊，影響因子 42.5 再創新高！熱烈祝賀！

l 文獻標題：Hijacking ERAD for targeted degradation of transmembrane proteins

l 研究單位：復旦大學發表

l 期刊：CELL

l 影響因子：42.5

期刊名稱：《CELL》

靶向蛋白降解（TPD）技術為藥物發現提供了巨大機遇，但降解跨膜（TM）靶點仍然充滿挑戰。由于TM蛋白在內質網膜上規范地折疊，我們假設利用ER相關降解（ERAD）可能實現TM蛋白的高效降解。在此，我們建立了一種TPD技術，將其命名為ERAD結合嵌合體（ERADECs），能夠高效降解TM靶點。我們鑒定了地奈德是SYVN1的結合劑，SYVN1是一種介導ERAD的ER E3連接酶。我們通過將去sonide與已知的PD-L1配體連接，設計了針對程序性死亡配體1（PD-L1）的ERADECs，并以高效能觀察到SYVN1和ERAD依賴的PD-L1降解。在功能上，這些ERADEC在腫瘤抑制和PD-L1降低作用上表現得比臨床使用的PD-L1抗體更為顯著。ERADEC的概念也可擴展到其他膜靶點。我們共同建立了一種平臺技術，利用ERAD以極高的效率選擇性降解TM靶點。

我們榮幸地向長期使用中喬新舟細胞以及專用培養基的合作伙伴致以熱烈祝賀由復旦大學研究團隊完成的成果《Hijacking ERAD for targeted degradation of transmembrane proteins》發表于國際知名期刊《CELL》(IF=42.5)。在該研究中，作者團隊選用了中喬新舟提供的A-375人惡性黑色素瘤細胞專用培養基（貨號：ZM0042），NCI-H1975人肺腺癌細胞專用培養基（貨號：ZM0395），MDA-MB-231人乳腺癌細胞（貨號：ZQ0118），NCI-H1975人肺腺癌細胞（貨號：ZQ0395），A375人惡性黑色素瘤細胞（貨號：ZQ0042）用于關鍵細胞模型的培養。

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一、研究背景與科學問題

靶向蛋白降解（TPD）技術，如蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs），劫持細胞內降解機制以選擇性降解目標蛋白，并為藥物發現提供了有前景的新途徑。同時，這些方法在降解大多數跨膜（TM）蛋白方面面臨挑戰，因為這些蛋白在很大程度上無法被這些TPD策略所啟動的降解機制接觸到。由于TM蛋白的重要性，科學家們已建立了幾種針對它們的TPD策略，例如溶酶體靶向嵌合體（LYTACs）、共價工程化納米抗體嵌合體（GlueTACs）、和轉鐵蛋白受體靶向嵌合體（TransTACs）等，它們開辟了前所未有的機會。同時，所有這些技術都依賴于內體-溶酶體途徑，因此受到回收內體的影響，這些內體傾向于將TM目標回收回去，從而降低它們的降解效率。此外，這些目標蛋白還會不斷被內含新合成蛋白的細胞內囊泡補充。最后，大多數TPD策略使用大分子生物物質如抗體，而小分子化合物可能提供若干優越特性，如更易遞送、更低成本、多用途應用途徑、長儲存穩定性，且通常不具有免疫原性。因此，建立能夠高效降解TM目標的小分子TPD策略是非常需要的。大多數TM蛋白在合成過程中通常在內質網（ER）中折疊。然后它們被打包進囊泡用于運輸到高爾基體，隨后再到質膜，在此過程中它們在孤立狀態下大多無法被降解酶和降解機制接觸。因此，它們通常對當前劫持細胞內降解機制（如泛素-蛋白酶體系統（UPS）或自噬）的降解劑具有抗性。與此同時，由于跨膜（TM）蛋白通常在內質網（ER）中正確折疊，它們可以被ER相關降解（ERAD）所接觸。

二、核心優勢

本研究建立“一種劫持ERAD的TPD策略“，ERAD是一條關鍵的降解通路，能夠通過多種不同途徑降解TM蛋白、分泌蛋白或錯誤折疊的胞質蛋白。ERAD由內質網膜相關的E3連接酶（ER-E3）通過對目標蛋白的多泛素化（poly-Ub）啟動。在多泛素化之后，底物被p97/VCP（含瓜氨酸蛋白）ATP酶轉運到胞質區，并在提取過程中由p97/VCP結合的去泛素化酶（DUBs）去泛素化，然后底物重新被泛素化并靶向蛋白酶體降解。在TPD領域中，ERAD在很大程度上被忽視，并且此前沒有利用ERAD劫持的TPD方法。團隊假設，與ER-E3和目標蛋白同時相互作用的化學嵌合體可能通過ERAD觸發選擇性降解，這在TPD中尚未被利用?；谶@一假設以及意外發現的可與主要ER-E3 SYVN1相互作用的化學配體，建立了一種劫持ERAD的TPD策略，稱為ERAD-介導的嵌合體（ERADECs）。

三、實驗方法與主要結果

1. 去索尼德被鑒定為SYVN1結合化合物

研究團隊最近確定地塞尼德（desonide）是一種針對亨廷頓?。℉untington’s disease）致病突變型HTT蛋白（mHTT）的小分子降解劑。地塞尼德誘導mHTT多泛素化（poly-Ub）以增強其降解，因此我們使用小干擾RNA（siRNA）敲低測試了可能直接與mHTT相互作用的多泛素化相關酶的潛在參與（圖S1A和S1B）。這些酶的選擇基于HDinHD數據庫，并通過文獻確認其在mHTT降解中可能的參與，這一作用通過地塞尼德誘導降低HEK293T細胞中外源表達的mHTT exon1 Q72片段來測量（圖S1A）。敲低SYVN1完全抵消了地塞尼德處理對mHTT水平的下降，提示SYVN1的參與（圖S1B），SYVN1是酵母Hrd1的哺乳動物同源物，也是ERAD中發揮主要作用的內質網E3。我們進一步通過測試mHTT的多泛素化證實了這一點，地塞尼德處理增強了多泛素化，而敲低SYVN1后這種效應幾乎被阻斷（圖1A）。我們觀察到地塞尼德誘導的高分子量血凝素（HA）條帶增加，這與通過過表達泛素導致的mHTT多泛素化增加相對應（圖S1C），從而確認地塞尼德誘導mHTT多泛素化。為了測試其潛在機制，我們進行了共免疫沉淀（coIP），觀察到地塞尼德處理增強了mHTT與SYVN1的相互作用（圖1B）。K6R突變（Q72K6R）對地塞尼德具有抗性，并且是已知的地塞尼德結合蛋白——糖皮質激素。

圖1：地索奈德直接與SYVN1相互作用

l (A) 使用HEK293T細胞進行代表性免疫沉淀-西方印跡實驗，這些細胞轉染了所示的cDNA質粒（24小時）和siRNA（48小時），然后用3 μM地索尼德（+）或含100 nM環氧霉素聯合處理的DMSO（-）對照處理24小時。

l (B) 使用HEK293T細胞進行代表性免疫沉淀-西方印跡實驗，這些細胞轉染了GR-FLAG、SYVN1-FLAG和mHTT-HA cDNA質粒（36小時），然后僅用3 μM地索尼德（+）或DMSO（-）對照處理2小時，以避免隨后降解。

l (C) 代表性下拉實驗，使用地塞米松-生物素（+）或生物素對照（-）與 A375 細胞孵育，通過西方印跡確認其與 SYVN1 的相互作用。

l (D) 使用重組純化蛋白的代表性表面等離子體共振（SPR）檢測結果顯示，地塞米松-生物素而非生物素可直接與 SYVN1 相互作用。muGFP 蛋白被用作對照蛋白。

l (E) 類似于 (D)，但使用 MST 測定法測試 desonide-SYVN1 相互作用。α-突觸核蛋白-MBP 蛋白被用作對照蛋白。

l (F) 類似于 (E)，但使用 ITC 測定法。在本圖及以下圖的所有 Western 印跡中，未裁剪的凝膠圖像顯示在 Data S1 中。

2. 基于地塞米松的ERADECs能夠降低PD-L1蛋白水平

研究團隊考慮將地塞米松連接到已知的TM蛋白靶點的配體/抑制劑上，以驗證ERADEC的概念。通過比較地塞米松和其他保留或消除了SYVN1結合的GR激動劑的結構（圖1E、1F、S1E和S1F），并考慮到將生物素連接到地塞米松的C-20位置并未破壞SYVN1結合（圖1C），C-21羥基可能不是SYVN1結合所必需的，并可用于連接鏈接物以合成潛在的ERADEC。 因此，我們通過將地塞米松與PD-L1配體BMS-202連接（圖2A），生成了靶向程序性死亡配體1（PD-L1）的ERADEC，并測試了它們對PD-L1水平的影響（圖2B和2C）。值得注意的是，10種不同的靶向PD-L1的ERADEC（P-ERADEC P1–P4和P8–P13）在MDA-MB-231和A375細胞中以pM–nM濃度范圍顯著降低了PD-L1水平（圖2B和2C；數據S2A和S2B）。然而，一些僅含柔性聚乙二醇（PEG）鏈接物的P-ERADEC（P5–P7）未能降低PD-L1（圖2C；數據S2B）。大多數有效的含酯鏈接物的P-ERADEC表現出亞nM的DC50和>90%的Dmax，而含酰胺鏈接物的P-ERADEC P12和P13對細胞內水解更具抵抗力，其效力和效能類似（圖2B和2C）。我們進一步通過流式細胞術分析完整A375細胞確認了質膜PD-L1水平的下降（圖2D）。P2誘導的PD-L1下降相對較慢（超過12小時）（圖2E），這可能是因為ERADEC主要直接降解靶蛋白的內質網池而非跨膜池。

圖2. 基于地塞米松的ERADECs降低A375細胞中的PD-L1蛋白水平

l (A) P-ERADECs 的化合物設計圖和二維結構。

l (B) 使用 A375 細胞在分別用指定濃度的 P1 或 P2 處理 48 小時后的代表性西方印跡及定量結果。

l (C) P-ERADECs 的 PD-L1 DC50（半最大降解濃度）和 Dmax（最大降解）的表格

l (D) 用流式細胞術分析 A375 細胞在用指定濃度 P2 處理 48 小時后的質膜 PD-L1 蛋白水平。

l (E) 使用 A375 野生型（WT）細胞和 A375 SYVN1 敲除（KO）細胞，在有或沒有 50 nM P2 處理不同時間（分別為 2、4、6、12、24 和 48 小時）下的代表性西方印跡及定量分析。所有柱狀圖表示平均值 ± SEM。ns，p > 0.05；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001

3. ERADECs 通過 SYVN1 和 ERAD 降低 PD-L1 蛋白水平

關于ERADECs特異性的一個擔憂是，我們當前的彈頭，它可以作用于SYVN1，同時也是一個GR激動劑。GR不太可能介導降解效應，因為使用另一種GR激動劑潑尼松龍的化合物未能引起靶標降解。

圖3. ERADECs 通過 SYVN1 和 ERAD 降低 PD-L1 蛋白水平

l (A) 在 MDA-MB-231 細胞中轉染所示 siRNA 48 小時后，再用 500 nM P3 或 DMSO 對照處理 24 小時，對 PD-L1 水平進行代表性免疫印跡及定量分析。

l (B) 類似于 (A)，但使用 U-251MG 細胞，有或沒有 SYVN1 基因敲除，處理 500 nM P8。

l (C) 使用轉染表達 PD-L1-HA 和泛素質粒的 U-251MG 細胞進行代表性免疫共沉淀-免疫印跡及定量分析，以檢測 P2 誘導的 PD-L1 多聚泛素化。A375 細胞用 50 nM P2 處理 6 小時以誘導多聚泛素化，并用 500 nM CB5083 處理以防止多聚泛素化 PD-L1 的降解。

l (D) MDA-MB-231 細胞用所示化合物處理 48 小時后進行代表性免疫印跡及定量分析。P3，500 nM；MG132，1 μM；氯喹 (CQ)，20 μM。

4. ERADECs 在涉及 Tyr227 的 TM 囊口中與 SYVN1 相互作用，并誘導三元復合物的形成

鑒于KDM5B促進糖酵解，我們首先試圖將這一代謝性狀與下游信號傳導聯系起來。TCGA-PRAD數據集的GSEA顯示，高KDM5B表達組中“通過切合體進行替代mRNA剪接”通路富集（ES = 0.6876，NP = 0.0000）。這促使我們假設KDM5B驅動的乳酸積累可能影響AR切割，從而產生抗性相關變異體AR-V7。支持這一觀點的是，在我們的小鼠CDX模型中，KDM5B敲低細胞的腫瘤組織乳酸水平較低。當腫瘤組織接受乳酸處理時，AR-V7 mRNA水平隨時間和劑量變化增加，確立乳酸與AR-V7表達之間的直接聯系。

圖4. P-ERADECs 可能結合在 SYVN1 的 TM 域中的 TM3–8 口袋處

l (A) 代表性 MST 實驗結果顯示，純化的重組 SYVN1 TM1–8 域對所示的 P-ERADECs 表現出結合。

l (B) Desonide（碳原子顯示為青色）與 SYVN1（碳原子顯示為綠色）的前兩個分子對接模型。圖中顯示了 TM 結構、氫鍵長度（埃）、以及參與的殘基（碳原子顯示為黃色）。

l  (C 和 D) 類似于 (A)，但使用所示的 SYVN1 TM 片段。

l (E) 使用過表達的 SYVN1 TM 片段進行競爭實驗。對轉染了所示質粒并在之后用 P2 處理 48 小時的 A375 細胞進行的 Western 印跡及定量分析證實了競爭現象。柱狀圖表示均值 ± SEM。ns, p > 0.05；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。另見圖 S4–S7

5. PD-L1 ERADECs 的特異性

我們進一步基于模型1和模型2，通過LigPlot分析了可能與地索尼德相互作用的SYVN1氨基酸（圖5A）。我們在一個構建體中（SYVN1-5mut）或在各自的單獨構建體中進行預測參與地索尼德與SYVN1結合的關鍵氨基酸突變（E87A、W118F、Y227F、L250S和Q254A）（圖5A），并在SYVN1敲除的U-251MG細胞中表達這些突變體或野生型（WT）全長SYVN1，以測試它們是否能夠恢復P-ERADEC的作用。與模型1預測的結合位點不一致，但與模型2預測一致，將全長SYVN1表達在SYVN1 KO U-251MG細胞中恢復了P-ERADEC P2處理下PD-L1的下降作用，而表達Y227F突變體或5突變SYVN1形式則未能實現這一點（圖5B、5C和S4E），將降解作用與化合物-SYVN1相互作用位點聯系起來，進一步確認了SYVN1的參與。結合位點通過直接生物物理實驗檢測二元結合（通過MST和ITC）得到了進一步確認（圖5D和5E）。

圖5. P-ERADECs可能與SYVN1的Y227相互作用以誘導靶向降解

l 蛋白質穩定性分析。用WT或K179R突變hnRNPA1重構的hnRNPA1-KO EnzR細胞，使用蛋白質合成抑制劑環己酰亞胺（CHX）（40微分）處理，可加乳酸或無乳酸（20微分）。西方印跡（A）和hnRNPA1半衰期（B）定量顯示乳酸穩定WT，但不穩定K179R hnRNPA1。

l 體內泛素化檢測。Flag-hnRNPA1的泛素化在EnzR細胞中低于親本細胞（C）。乳酸處理（20uM）減少，而氧酸鈉（20uM）增加，hnRNPA1泛素化（D）。

l (A) 前兩名對接模型的配體-受體相互作用的計算機預測。綠色標記的殘基參與氫鍵，其他殘基參與疏水相互作用。突變實驗中的突變氨基酸以黑圈標出。

l (B和C) 使用SYVN1敲除的U-251MG細胞，將其轉染SYVN1 cDNA（有或沒有所示點突變的WT）24小時后，并用P2處理24小時的代表性免疫印跡(B)及其定量(C)。柱狀圖表示平均值 ± SEM。****p < 0.0001。

l (D) 使用重組純化蛋白的代表性MST實驗結果顯示，SYVN1而非Y227F突變體表現出與P-ERADEC (P2或P11)的結合。

l (E) 類似于(D)，但使用ITC檢測地塞米松的結合。NBD，未檢測到結合。另見圖S5–S7。

四、總結

該研究建立了一種新型TPD策略，稱為ERADECs，它劫持了ERAD，這是一個尚未在其他TPD中利用的細胞內降解途徑。多種P-ERADECs表現出亞納摩爾級的DC50和超過90%的D max，明顯優于傳統基于細胞質E3的PD-L1靶向PROTACs，這些傳統方法通常表現為大于1 μM的DC50和約60%的D max。這可能是因為PD-L1在ER中折疊，因此對細胞質E3連接酶的可及性有限。膜PD-L1的自然半衰期約為3小時，表明膜中PD-L1部分降解迅速，降低了降解劑提升其降解的空間?？傄吧蚉D-L1的半衰期約為17–18小時，稍長于P-ERADECs發揮作用所需的時間。ERADECs的體內療效令人期待，表明具有良好的治療潛力。考慮到用于靶向ERADECs的SYVN1配體（地塞米松）親和力僅約為μM量級，ERADECs的療效仍有很大的進一步提升空間。

五、關于中喬新舟

本研究中使用了中喬新舟的A-375人惡性黑色素瘤細胞專用培養基（貨號：ZM0042），NCI-H1975人肺腺癌細胞專用培養基（貨號：ZM0395），MDA-MB-231人乳腺癌細胞（貨號：ZQ0118），NCI-H1975人肺腺癌細胞（貨號：ZQ0395），A375人惡性黑色素瘤細胞（貨號：ZQ0042），印證了高端科研對高品質細胞以及專用試劑產品的要求。

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