盡管當下的類器官作為可在體外復現生理結構和分子特性的3D平臺，已經在多種疾病的建模中展現出了無可比擬的還原忠實度，但其仍舊存在缺乏免疫系統、細胞類型單一、血管化不足等嚴重問題。其中，由于靜態培養的類器官模型缺少運輸氧氣和營養、清除廢物、運輸免疫細胞的血管網絡，隨著體外增殖進行，內部會逐漸出現中心區域壞死的現象。而在心腦血管疾病研究中，血腦屏障的整合對于藥物評價和測試更是具有巨大意義。因此，類器官血管化已經成為下一代體外模型的重點研究方向。

除移植腎被膜催化的“體內血管化”外，更多的研究者正在探索體外血管化的方案。一些研究則利用生物材料和生物打印技術，但在血管的成熟度和穩定性方面仍存在不足。與具備血管網絡自組裝能力的血管內皮細胞共培養是另一個可行的方向，但獲得的類器官具有不同水平的內皮細胞、平滑肌細胞和祖細胞，不利于模型穩定性。

2025年6月5日，斯坦福大學研究團隊在頂刊Science發表重磅論文“Gastruloids enable modeling of the earliest stages of human cardiac and hepatic vascularization”，報道了一種能夠模擬人類心臟和肝臟早期血管化過程的體外類器官模型。該團隊從人多能干細胞（hPSCs）出發，通過微圖案化及CHIR添加，首先誘導了中胚層的有序分化與心血管祖細胞的形成，隨后添加血管化誘導因子VEGF/FGF2/SB/ANG1/2/PDGF-BB/TGF-β1等，成功構建了具有心肌細胞、內皮細胞和平滑肌細胞的心臟類器官（cVOs），并在多重表征鑒定中確定其具有近似人胎兒心臟的血管網絡與心肌功能。該模型可用于體外心血管機制的深入探索，并具有普適性，可遷移并培養肝臟血管化類器官（hVOs），對于臨床研究具有重要啟示意義。

圖：微模式化和生長因子的添加是實現了類原腸胚、心血管、祖細胞和cVO的體外形成

此前的研究已經表明，hPSC的幾何微圖案化（Micropatterning）通過在基底上創建特定的幾何形狀或化學模式，精確控制細胞的生長環境，從而以可重復和可擴展的方式形成在空間上具有明確排列和組織結構胚層（包括內胚層、中胚層和外胚層），并可進一步發育為心臟類器官等。此外，GSK3β抑制劑CHIR也已被證明可以增強Wnt信號傳導、從而促進中胚層的形成與分化。

因此，本研究首先使用了模具對hPSC和人胚胎干細胞（hESC）進行微圖案化、并加入了CHIR進行中胚層分化誘導，力圖同時生成心肌細胞（CM，負責心臟的收縮和舒張）、內皮細胞（EC，血管內皮的主要成分）和平滑肌細胞（SMC，負責血管的收縮和舒張）三種構建功能性心臟類器官及心血管的關鍵細胞。

研究發現，未圖案化的hESCs在不同濃度的CHIR誘導下形成的胚層細胞呈無序分布。而微圖案化的hPSCs在CHIR誘導下能夠一致地生成有序的中胚層，表現為圍繞高度集中的中胚層形成了內胚層環，而外胚層在此缺失。這種有序的排列模式與體內胚胎發育過程中的胚層排列相似，表明微圖案化技術能夠模擬體內發育過程。

該結果表明，CHIR誘導和微圖案化對于具備三種細胞類型的心臟類器官的形成缺一不可。

圖：hPSC的微圖案化及CHIR的添加誘導了有序中胚層的形成，為CM、EC、SMC的同步生成奠定基礎

接下來，研究團隊將心血管祖細胞標志物NKX2與綠色熒光蛋白eGFP融合，發現單個微圖案化已經可以在10天的分化后產生心血管祖細胞，并進一步分化形成跳動的CM。

此外，三種熒光hPSC報告系統也證明，微模式化成功產生了有組織的胚層、心血管祖細胞和CM，從而為后續篩選能夠促進心臟血管化類器官（cVOs）形成的條件提供了基礎。

通過對34種不同培養條件的對比，研究者發現，添加細胞因子VEGF、FGF2、SB、ANG1/2、PDGF-BB、TGF-β1的組在血管化和功能化方面表現最優。

基于此，研究團隊確認了四階段的分化方案：

1. 中胚層誘導（第0天）：CHIR（5 μM） + FGF2（5 ng/mL）

2. 心血管前體形成（第3天）：IWR（5 μM）

3. 血管生成啟動（第5天起）：VEGF（50 ng/mL）+FGF2++ SB431542（SB，TGFβ抑制劑）+血管生成素-1/2(ANG1/2）

4. 血管成熟（第7天起）：血小板衍生生長因子 BB (PDGF-BB，10 ng/ml） +轉化生長因子-β1 (TGF-β1）

圖：cVO的分化方案

圖：cVOs的結構

在轉錄組層面，時序性bulk RNA-seq與WGCNA分析揭示，血管生成基因簇（如PECAM1、HIF1A、NOTCH4）在cVOs中特異性上調，峰值見于第16天。此外，大量與心臟發生和血管化相關以及一些已知在心血管發育中起重要作用的經典通路均有上調。尤其NOTCH通路關鍵基因（JAG1/2、DLL4、NOTCH1-4）從第5天（添加血管因子時）開始與對照組顯示出顯著的差異化表達。

對第16天的cVOs進行scRNA-seq，并與6.5孕周（PCW）人胚胎心臟（Carnegie Stages 19-20）聯合分析，發現cVOs包含15-17種心臟細胞類型，與6.5 PCW心臟（16種）高度重疊。但同時二者間也存在一定的差異，如cVOs中造血細胞比例較低，而成纖維細胞和心外膜細胞占比更高。此外，值得注意的是，cVO也未能囊括6.5-PCW 心臟或 Azimuth 成人心臟參考模型中發現的所有細胞類型。 

圖：cVO 包含多種心肌、血管、心內膜、心外膜和神經元細胞類型

在功能分析方面，最大強度投影 (MIP) 共聚焦成像和3D表面渲染證實了管腔化血管網絡的形成。電生理學實驗則發現，cVOs的節律性收縮與人類胚胎心臟相似。此外，鈣瞬變分析也證實，cVOs在功能上表現出比對照組更強的收縮力和更穩定的搏動節律，但同時也伴隨著更長的收縮舒張期，可能需要進一步的優化。

總之，以上結果表明，cVOs是一個具有功能性血管網絡的類器官模型。

NOTCH和BMP通路對心血管發育、疾病和再生至關重要。本文中，研究者利用已獲得的cVOs模型，發現添加任何劑量的NOTCH通路抑制劑DAPT均可以以非劑量依賴性方式抑制CM及EC生成，且對CMs的負面影響強于ECs。而Dorsomorphin對ECs的負面影響強于CMs，后者僅受到高劑量BMP抑制劑Dorsomorphin的抑制。

以上結果表明，BMP通路對血管形成的調控權重高于NOTCH通路，且雙通路抑制均破壞心-血管協同發育。

除cVOs外，研究團隊還利用相同的血管誘導因子組合（VEGF/FGF2/SB/ANG1/2/PDGF-BB/TGF-β1），成功構建了肝臟血管化類器官（hVOs），從而進一步驗證了該血管化策略的普適性。不同于發育自均中胚層的ECs、SMCs以及心血管祖細胞，肝臟中肝細胞和膽管細胞來自于內胚層，因此研究人員對培養方案進行了微調，將同步誘導內胚層與中胚層有序分化。

實驗結果顯示，hVOs在結構上具有明顯的層次結構，包含了肝臟細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞類型，具有功能性血管網絡。該結果表明，在不同器官系統中，血管的構建涉及一個保守的發育程序，提示該方案或可作為起點，在未來實現其他器官系統的血管化。

圖：cVOs分化方案成功誘導肝臟類器官血管化