Immunity｜T細胞「集體自殺」真相曝光！鄭大一附院張毅團隊破解腫瘤微環境「死亡代碼」PLPP1
英文標題：PD-1 signaling limits expression of phospholipid phosphatase 1 and promotes intratumoral CD8+T cell ferroptosis
中文標題：PD-1信號傳導限制磷脂磷酸酶1的表達并促進腫瘤內CD8+T細胞鐵死亡
發表期刊：Immunity
影響因子：25.5
客戶單位：鄭州大學第一附屬醫院
百趣提供服務：經典脂質組學、定量脂質組學、游離脂肪酸
研究背景
新陳代謝在機體對癌癥的免疫反應中占據著至關重要的地位。腫瘤內葡萄糖、脂質和氨基酸代謝的改變，會對免疫細胞的抗腫瘤活性產生顯著影響，進而推動腫瘤的發展進程。其中，脂質代謝不僅在調節細胞信號轉導方面發揮著關鍵作用，還為細胞活動提供必要的能量支持，而脂質代謝過程中產生的脂質介質，能夠從多個維度對免疫反應進行調控。腫瘤微環境(Tumor Microenvironment, TME)是一個極為復雜且代謝紊亂的環境。在這樣的環境中，CD8+T細胞的脂質代謝出現異常。這種異常進一步加劇了CD8+T細胞的耗竭，使其在增殖能力和免疫功能方面表現不佳。磷脂作為眾多細胞類型中含量最為豐富的代謝產物之一，在免疫反應中扮演著不可或缺的角色。它參與了多種免疫細胞功能的調節，對維持正常的免疫應答具有重要意義。
研究結果
1、瘤內CD8+T細胞中Plpp1的表達減少與抗腫瘤功能降低相關
研究者收集了5例肺癌患者的外周血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)和腫瘤組織樣本。相較循環活化CD8+(CD69+CD8+)T細胞，瘤內CD8+T細胞的脂質代謝發生改變：甘油磷脂占比最高（76%，圖1A），包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)和心磷脂(CL)，其中PC和PE差異最大（圖1B），表達減少（圖1C）。PC和PE的合成主要由PLPP1催化，瘤內CD8+T細胞中的異常磷脂代謝可能受PLPP1控制（圖1D）。在肺癌患者中，瘤內CD8+T細胞中的PLPP1 mRNA和PLPP1蛋白水平較循環CD8+T細胞的低（圖1E-G）。相較于PLPP1hiCD8+T細胞，PLPP1loCD8+T細胞內干擾素(IFN)-γ和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達量低（圖1H）。
基于GEO數據庫中36例初治早期肺癌患者腫瘤組織的CD8+T細胞RNA測序的GSEA結果表明，PLPP1hiCD8+T細胞具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生，活性氧(ROS)代謝負調控的特征（圖1I）。KEGG通路分析顯示，PLPP1hi組DNA復制、細胞分裂和細胞周期的轉錄特征增強（圖1J）。PLPP1表達與T細胞活化和細胞毒性特征基因的表達呈正相關，而與IFNGR1的表達呈負相關（圖1K），后者同T細胞活化誘導的細胞凋亡相關。結果表明，PLPP1介導的瘤內CD8+T細胞磷脂代謝受損，從而觸發CD8+T細胞功能障礙。
圖1.瘤內CD8+T細胞中參與磷脂代謝和功能的PLPP1表達低
2、Plpp1缺陷通過鐵死亡降低瘤內CD8+T細胞的細胞毒性功能
研究者進一步探究了Plpp1是否調控CD8+T細胞的行為。與Plpp1fl/fl小鼠相比，僅在T細胞區缺乏Plpp1的Lckcre-Plpp1fl/fl小鼠表現出更快的B16黑色素瘤生長速率（圖2A）和更短的生存時間（圖2B）。而當CD8+T細胞被耗竭時，二者的腫瘤生長和存活率相似（圖2C-D）。在B16和Lewis肺癌(LLC)中，Lckcre- Plpp1fl/fl小鼠的CD8+T細胞數量較Plpp1fl/fl少（圖2E）。將用eFluor 670染色的Lckcre-Plpp1fl/flCD8+OT1 T細胞和用CFSE染色的Plpp1fl/flCD8+OT1 T細胞激活、混合，轉移到攜帶腫瘤的小鼠體內（圖2F）。Plpp1缺失導致細胞分裂頻率顯著降低（圖2G）。此外，與Plpp1fl/flCD8+OT1 T細胞相比，瘤內Lckcre-Plpp1fl/flCD8+OT1 T細胞內，抗腫瘤相關基因表達低，共抑制標志物表達高，活化標志物表達低（圖2H-I）。這些結果表明，Plpp1的表達有助于CD8+T細胞的細胞毒性功能。
為了闡明潛在機制，研究者分析了B16腫瘤組織內浸潤的CD8+T細胞的轉錄組數據。與Plpp1fl/flCD8+T細胞相比，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞內參與細胞鐵死亡及細胞周期調節的基因表達上調，而有利于T細胞活化和存活的基因表達下調（圖2J）。GO分析結果表明，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞顯示出與氧化應激、氧化磷酸化和脂肪酸代謝相關的基因表達模式增強（圖2K）。與Plpp1fl/fl相比，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞內與脂質過氧化或鐵死亡激活相關的基因表達更高（圖2L）。與氧化應激和鐵死亡相關的基因在Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞中富集（圖2M）。
研究發現，瘤內Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞的細胞死亡率高于瘤內Plpp1fl/flCD8+T細胞（圖2N）。Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞的細胞死亡率僅在鐵死亡抑制劑(ferrostatin-1)的作用下降低，而在細胞凋亡抑制劑(Z-VAD-FMK)或壞死性凋亡抑制劑(necrostatin-1)作用下不能（圖2O）。Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞的功能和增殖也僅能被ferrostatin-1改善（圖2P-Q）。為了確定鐵死亡對T細胞抗腫瘤功能的影響，研究者使用鐵死亡激動劑（FIN56和RSL3）培養Plpp1fl/flCD8+T細胞，發現CD8+T細胞的功能和增殖受到抑制，表明鐵死亡抑制了CD8+T細胞的抗腫瘤功能。此外，研究者還用RSL3或ferrostatin-1處理陰性對照(NC)和Plpp1過表達(Plpp1-OE)OT1 CD8+T細胞，并將其注射到攜帶腫瘤的小鼠體內。體內實驗顯示，NC CD8+T細胞比Plpp1-OE CD8+T細胞有更高的細胞死亡率和更弱的抗腫瘤功能。在用ferrostatin-1處理后，NC CD8+T細胞實現了同Plpp1-OE CD8+T細胞相似的細胞死亡率和抗腫瘤功能。在用RSL3處理后，Plpp1-OE CD8+T細胞較NC CD8+T細胞表現出更低的細胞死亡率和更高的T細胞功能（圖2R-S）。綜上，研究強調Plpp1是CD8+T細胞鐵死亡的重要調節因子，可影響T細胞抗腫瘤功能。
圖2.Plpp1缺陷損害CD8+T細胞的存活和抗腫瘤反應
3、脂肪酸誘導Plpp1缺陷型CD8+T細胞的鐵死亡
接下來，研究者檢測了腫瘤內浸潤的Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞的鐵死亡。B16腫瘤中，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞的ROS水平和脂質過氧化高于Plpp1fl/flCD8+T細胞（圖3A-B）。ROS有助于線粒體結構的變化。電子顯微鏡顯示，大多數線粒體中的嵴在Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞中是無序的（圖3C）。與Plpp1fl/flCD8+T細胞相比，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞中的線粒體面積更小，嵴長度更短（圖3D-E）。
與腫瘤組織共培養后，Plpp1fl/fl和Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞均表現出更高的ROS水平及更高程度的脂質過氧化（圖3F-G）。然而，與前者相比，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞更易于在與腫瘤組織孵育時誘導鐵死亡（圖3F-G）。脂肪酸是調控T細胞鐵死亡的主要物質。B16腫瘤和LLC腫瘤的腫瘤間質液(TIF)內的游離脂肪酸(FFA)含量高于血清或脾臟（圖3H）?；诖耍現FA在腫瘤組織中積聚，可能誘導鐵死亡。此后，研究者檢查了脂肪酸對CD8+T細胞鐵死亡和抗腫瘤功能的影響。結果發現，用5或10 μM脂肪酸處理的Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞比Plpp1fl/flCD8+T細胞有更高的ROS和脂質過氧化水平（圖3I-J）。對Plpp1fl/flCD8+T細胞做類似處理后發現，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞的功能更弱（圖3K-L）。以上表明，腫瘤部位積累的脂肪酸加劇了Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞的鐵死亡。
圖3.Plpp1缺陷加劇脂肪酸介導的CD8+T細胞鐵死亡
4、不飽和脂肪酸促進Plpp1缺陷型CD8+T細胞的鐵死亡
研究者推測腫瘤中誘導鐵死亡的脂肪酸可能是不飽和脂肪酸。定量代謝組學結果顯示，腫瘤中的不飽和脂肪酸含量高于脾臟（圖4A），而幾種飽和脂肪酸的含量較脾臟低（圖4B）。
花生四烯酸(AA)和十八碳烯酸(OA)可誘導鐵死亡。用AA或OA處理后，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞中含有AA或OA的PC和PE的差異倍數高于Plpp1fl/flCD8+T細胞內的（圖4C-D）。在Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞中，AA和OA通過這些通路使鐵死亡增加，T細胞受體信號通路、糖酵解和丙酮酸代謝減少（圖4E-F）。數據表明，不飽和脂肪酸改變磷脂種類以誘導Plpp1缺陷型CD8+T細胞發生鐵死亡。
研究者發現AA促進了T細胞死亡，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞死亡率高于Plpp1fl/flCD8+T細胞。Ferrostatin-1能降低AA處理后的Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞的死亡率（圖4G）。AA誘導的ROS水平和脂質過氧化在Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T細胞中較Plpp1fl/flCD8+T細胞中高（圖4H-I）。此外，研究者發現用Plpp1激動劑處理體外激活的CD8+T細胞后，AA誘導細胞死亡率、ROS和脂質過氧化的作用被抵消（圖4J-L）。最后，構建了間皮素(MSLN) 靶向嵌合抗原受體T(CAR-T)細胞和PLPP1過表達MSLN(MSLN-PLPP1)CAR-T細胞（圖4M）。PLPP1過表達可增加CAR-T細胞中磷脂的水平（圖4N-O），能更有效地抑制腫瘤生長（圖4P），MSLN-PLPP1 CAR-T細胞的功能和增殖也得到了增強（圖4Q-R）?？偟膩碚f，這些結果突出表明PLPP1是維持CD8+T細胞存活和正常功能所必需的。
圖4.腫瘤中積聚的不飽和脂肪酸誘導Plpp1缺陷型CD8+T細胞鐵死亡
5、PD-1信號抑制瘤內CD8+T細胞中Plpp1的表達
瘤內CD8+T細胞中的Plpp1表達下降，表現出鐵死亡的特征。為了探索潛在的機制，研究者將CD8+T細胞與肺癌細胞共培養，發現CD8+T細胞中的PLPP1 mRNA表達下降（圖5A）。將小鼠CD8+OT1 T細胞同黑色素瘤細胞B16過表達卵清蛋白(B16-OVA)共孵育，獲得了類似的結果（圖5B）。PD-1和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA4)是主要的T細胞功能抑制因子。觀察到當使用PD-1阻斷抗體而不是CTLA4阻斷抗體時，CD8+T細胞中PLPP1蛋白量的下調更少（圖5C），因此推測PD-1信號可能調節PLPP1表達。
為了驗證假設，重新分析了活化的人源CD8+T細胞(TACT)和TACT與PD-1信號激活劑程序性死亡配體1(PD-L1)Fc(TACT+PD-L1)共培養的RNA-seq數據集。同TACT組相比，TACT+PD-L1組PLPP1 mRNA表達減少（圖5D）。成像流式細胞術證實，PD-L1 Fc誘導的PD-1信號激活下調了活化的CD8+T細胞中的PLPP1和IFN-γ水平（圖5E）。此外，通過用IFN-γ培養MC38腫瘤細胞以增加PDL1的表達，然后固定PDL1并用于刺激PD-1信號通路。在與固定MC38腫瘤細胞共培養的CD8+T細胞中，脂質過氧化、ROS產生和細胞死亡率均增加，而它們都被PD-1阻斷劑削弱（圖5F-H）。這些結果表明，PD-1信號激活誘發T細胞鐵死亡。
接下來，研究者將活化的OT1 T細胞經靜脈過繼性轉移到攜帶B16-OVA腫瘤的小鼠體內（圖5I）。與對照小鼠相比，抗PD-1治療減緩了腫瘤生長（圖5J），減少了肺中腫瘤結節的數量（圖5K）?？筆D-1治療增加了腫瘤組織中表達Plpp1、Ki67和IFN-γ的CD8+T細胞的占比（圖5L-N）。此外，在抗PD-1治療后，瘤內CD8+T細胞的細胞死亡率和脂質過氧化降低（圖5O-P）。綜上，這些發現表明PD-1信號的激活抑制了Plpp1表達，以致CD8+T細胞鐵死亡。
圖5.PD-1信號轉導限制CD8+T細胞中Plpp1的表達，損害抗腫瘤免疫
6、GATA1受PD-1信號調節并限制PLPP1表達
PD-1介導的Akt通路參與調節T細胞的增殖和功能。研究者發現PLPP1hiCD8+T細胞表現出增強的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt機制/哺乳動物雷帕霉素靶 (mTOR) 通路活性（圖6A）。假設PD-1介導的Akt通路可能抑制PLPP1。磷酸化Akt(p-AKT)被PD-L1 Fc抑制（圖6B）。用抗PD-1抗體處理后，TME中過繼轉移的CD8+OT1 T細胞中p-AKT占比增加（圖6C），而Plpp1不影響p-AKT的百分比（圖6D）。此外，使用激活的人源CD8+T細胞（有或沒有PD-L1 Fc處理），創建RT2 profiler PCR陣列，監測能夠控PLPP1表達的轉錄因子，最終鑒定出了14個轉錄因子（圖6E）。使用PROMO網站確定了76個與PLPP1啟動子區域結合的潛在轉錄因子。最后，綜合以上結果，確定了五個轉錄因子(GATA1、E2F1、HNF1A、HNF4A、ARNT)。染色質免疫沉淀定量PCR (ChIP-qPCR)顯示GATA1在PLPP1位點顯著富集（圖6F）。與對照組相比，Akt抑制劑處理組的GATA1結合富集增加（圖6G）。PD-L1 Fc處理增加了GATA1的核轉位，而加用PD-1阻斷抗體處理后，該現象明顯減少（圖6H）。正如預期，Akt抑制劑抑制了小鼠活化CD8+T細胞中Plpp1蛋白表達，促進了GATA1的表達，并下調了白細胞介素(IL)-2和Ki67的表達（圖6I-K）。在Akt抑制劑處理的CD8+T細胞中，GATA1的核轉位增加（圖6L）。
此外，為了評估GATA1對PLPP1表達和抗腫瘤功能的影響，構建了GATA1sh OT1 T細胞和T細胞過繼轉移腫瘤模型（圖6M）。結果顯示，GATA1sh組PD-1+CD8+T細胞中Plpp1蛋白量較NC組更高（圖6N）。與NC組相比，GATA1sh中OT1 T細胞浸潤和抗腫瘤功能更強（圖6O-P）。以上表明，PD-1信號通過Akt-GATA1通路抑制Plpp1表達，導致CD8+T細胞功能障礙。
圖6.PD-1誘導的GATA1與PLPP1啟動子結合以改變PLPP1表達
7、Plpp1缺陷減弱了體內抗PD-1治療的反應
研究者用Plpp1fl/fl或Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞及PD-1阻斷抗體或免疫球蛋白G(IgG)治療B16-OVA腫瘤攜帶小鼠（圖7A）。接受過繼轉移Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞，用PD-1阻斷抗體處理的小鼠腫瘤比用IgG處理的長得慢；然而，接受過繼轉移Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞，用IgG處理的小鼠與用PD-1阻斷抗體處理的小鼠，腫瘤生長曲線類似（圖7B）。TME中，PD-1阻斷劑增加了Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞的頻率，而Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞占比沒有增加（圖7C）。此外，PD-1阻斷增加了表達IFN-γ的Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞的百分比，但不增加Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞的，表達IFN-γ的Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞占比較Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞低（圖7D）。
研究者從接受PD-1阻斷抗體治療的B16腫瘤中分離出浸潤的CD8+T細胞，并進行了scRNA-seq測序。Plpp1fl/fl和Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞表現出8個不同的簇（圖7E）。Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞主要集中在簇1、2和3，而簇0、4、5、6在Plpp1fl/flCD8+T細胞中富集（圖7F）?；赥細胞亞型（幼稚/記憶、效應和耗竭）的標志物，聚類3被鑒定為幼稚簇，而聚類1表現出耗竭亞型。與鐵死亡相關的標志物在第2簇中增加。簇0和6中有絲分裂相關基因的表達相對較高。簇4、5和7被鑒定為效應亞型（圖7G）。超氧化物合成的NADPH氧化酶激活劑活性、氧化應激應對、細胞死亡調節和細胞脂質代謝過程在簇2中富集，表明抗PD-1治療并沒有減少Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T細胞的鐵死亡（圖7H）。簇1中細胞死亡途徑的負性調控降低。在第3簇中，繁殖和激活的相關途徑減少，包括鈣依賴性磷脂結合、氧化磷酸化和磷脂代謝過程（圖7H）。
此外，研究者整合并分析了來自不同類型人類腫瘤的單細胞RNA測序數據。PD-1+CD8+T細胞的分析產生了10個簇（圖7I）。簇3可能是一個高度增殖的亞群，其內PLPP1高表達（圖7J）。使用來自GEO:GSE90730的轉錄組數據，可見PLPP1表達與抗PD-1治療的響應基因增加呈正相關（圖7K）。在36名食管癌患者（圖7L）和58名晚期肺癌患者（圖7M）中，CD8+T細胞中的PLPP1表達與Ki67表達高度相關。CD8+T細胞中的PLPP1表達與T細胞細胞毒性細胞因子相關（圖7N）。在17名食管癌患者和35名晚期肺癌患者中，抗PD-1治療促進了PLPP1的表達（圖7O）。這些結果強調PLPP1賦予CD8+T細胞增殖和細胞毒性的能力，而這可以通過抗PD-1得到治療性的恢復。
圖7.Plpp1缺陷減弱了體內對抗PD-1療法的反應
研究結論
該研究探討了腫瘤微環境中CD8＋T細胞的磷脂代謝調控機制及其與PD-1信號通路的關聯。研究發現，腫瘤內CD8＋T細胞的PLPP1表達顯著下調，導致PC和PE合成減少，進而誘發鐵死亡，削弱CD8＋T細胞的抗腫瘤功能。機制上，PD-1信號通過Akt-GATA1通路抑制PLPP1表達，而腫瘤微環境中積聚的不飽和脂肪酸（如花生四烯酸、十八碳烯酸）進一步驅動PLPP1缺陷型CD8＋T細胞發生鐵死亡。體內實驗表明，PLPP1缺陷會削弱抗PD-1治療的效果，而恢復PLPP1表達可增強CD8＋T細胞對免疫治療的響應。該研究揭示了PD-1信號通過調控磷脂代謝促進CD8＋T細胞鐵死亡的新機制，為優化腫瘤免疫治療策略提供了潛在靶點。
END
仲航 撰文
Tang 校稿