病原體引起的傳染病嚴重影響人類健康，據統計每年因傳染病失去生命的人占總死亡人口的25%。自2020年新冠疫情爆發以來，全世界都籠罩在疫情的陰霾之下。因此在突發性傳染病爆發時，能夠快速檢測識別病原體對遏制疫情擴散與疾病的治療至關重要[1-3]。
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主流的病原體檢測方式大多基于免疫學（如：ELISA）或聚合酶鏈式反應（PCR）原理，但是在突發性傳染病爆發時，制備有效的抗體所需周期較長，而基于PCR的檢測手段對設備要求較高，在一些物資匱乏的地區難以第一時間配備設備，錯過最佳防控時機[4, 5]。
CRISPR技術在作為繼ZFN和TALEN之后的第三代基因編輯技術，在各個領域大放異彩。在體外診斷方面由于CRISPR/Cas9系統對靶標序列的精準識別，造就了基于此原理的新型生物傳感器優良的檢測性能。
基于CRISPR/Cas9系統的分子診斷大致可分為兩類，一是基于切割功能的檢測方法，另一種是基于定位功能的檢測方法。
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(一)基于切割功能的檢測手法
NASBA-CRISPR Cleavage(NASBACC)技術
Cas9僅在具有PAM序列的情況下才具有切割能力，而任何隨機突變都有48%的概率創造一個新的PAM位點或者破壞現有的PAM位點，因此可以利用特異性的PAM位點來區分菌株的譜系。
NASBA-CRISPR Cleavage(NASBACC)[6]將依賴核酸序列的擴增技術NASBA、toehold開關RNA傳感器和CRISPR/Cas9系統進行結合，在特異性PAM序列和gRNA靶點的存在下，NASBA反應合成的雙鏈DNA被Cas9切割，截短的RNA產物中缺少傳感器H，所以無法激活toehold開關。而在沒有PAM序列的情況下，就可以產生包含傳感器H觸發序列的全長RNA產物，從而激活傳感器H。然后RBS和起始密碼子被釋放，激活LacZ基因翻譯表達β-半乳糖苷酶，該酶可將黃色底物（氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷）轉化為紫色產物（氯酚紅），從而實現肉眼可見的顏色變化。近岸蛋白的NLS-Cas9 Nuclease（E365）可有效對雙鏈DNA進行切割，適用于體外剪切靶DNA的特異位點。
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圖1. NASBA-CRISPR 技術檢測原理[6]
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CASLFA技術
Wang X等[7]將Cas9介導的檢測技術整合至側流層析試紙條(Lateral flow detection，LFD) ，建立了新型的比色生物傳感系統CASLFA (CRISPR/Cas9- mediated lateral flow nucleic acid assay)。在這個體系中，利用生物素標記的引物對靶標DNA進行擴增，將擴增產物添加到反應體系后，Cas9/sgRNA會特異性識別靶標DNA并形成三元復合物。隨后將反應底物滴加至側流層析試紙條上，在毛細作用下，液體不斷地向前流動。當復合物流經結合墊時，AuNP-DNA探針會與sgRNA的環狀區域結合，形成四元復合物，隨后被固定在檢測線的鏈霉親和素捕獲，而過剩的AuNP-DNA會繼續向前流動并被質控線上的探針捕獲。由于AuNP的積累，會在檢測線與質控線上產生顏色帶，通過顯色即可判斷靶DNA是否存在。近岸蛋白的Cas9 (D10A, H840A) Nuclease（E368）在Cas9 Nuclease基礎上突變兩個切割活性中心，使其只具有靶DNA結合活性，但無切割活性，可有效應用于Cas9/sgRNA與目的DNA的特異性結合。
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圖2. CASLFA技術檢測原理[7]
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CAS-EXPAR技術
Cas9/sgRNA復合物對ssDNA底物進行定點切割，生成產物片段（X）。通過DNA聚合酶催化X與EXPAR模板雜交，得到雙鏈延伸產物。雙鏈產物隨后被NEase切割形成缺口，X的一個拷貝被Vent（外）DNA聚合酶從模板上釋放出來，解離的X繼續觸發新一輪的擴增反應[8]。近岸蛋白的Cas9（D10A）Nickase（E366）在Cas9 Nuclease基礎上突變其中一個切割活性中心，其能夠在與sgRNA靶序列互補的單鏈DNA上產生切口，從而形成功能性的單鏈斷裂。
圖3. CAS-EXPAR技術檢測原理[8]
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(二)基于定位功能的檢測方法
Paired dCas9(PC)技術
Paired dCas9(PC)技術是使用一對dCas9蛋白，分別融合熒光素酶的兩個分離結構域（NFluc和CFluc），并通過兩個靶向相鄰序列的gRNA實現檢測。其反應原理如圖4所示：當存在靶標DNA時，兩個分別帶有熒光素酶結構域的dCas9在gRNA的引導下結合到相鄰的靶標序列上，熒光素酶的兩個分離結構域相互靠近，形成有活性的熒光素酶，在ATP和氧氣存在條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，并產生可檢測的熒光信號[9]。
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圖4. Paired dCas9(PC)技術原理[9]
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dCas9/sgRNA-SG I DNA-FISH
Guk K等基于SYBR GREEN I熒光染料開發了dCas9/sgRNA-SG I DNA-FISH系統：即通過設計識別靶標基因的sgRNA序列，dCas9/sgRNA復合物能夠特異性識別靶標基因并形成三元復合物。由于dCas9蛋白帶有His標簽，所以利用anti-His磁珠可以將三元復合物分離，最后加入SYBR GREEN I與體系中的靶標DNA結合實現可視化檢測[10]。
圖5.dCas9/sgRNA-SG Ⅰ DNA-FISH技術原理[10]
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總結與展望
基于CRISPR/Cas9的新型體外檢測手段可以對多種病原微生物進行高效精準檢測。相較于傳統的檢測手段，CRISPR/Cas9類的生物傳感器大都不需要大型精密的儀器，對檢測場地沒有苛刻的要求，大大地降低了檢測的成本。除此之外，將CRISPR/Cas9系統與其他技術相結合，也能夠大大提高檢測的靈敏度與普適性。
基于CRISPR/Cas9的檢測手段在一些方面有著巨大優勢，但是在病原體檢測領域依然有著不可避免的局限性，比如上述的NASBA-CRISPR cleavage技術，Cas9只能對靶標序列進行切割，一旦靶標序列濃度過低，就會由于產物顏色過淺而無法讀取準確的實驗結果；Cas-EXPAR檢測步驟過多，所需試劑過于復雜。雖然該技術正處于起步階段，全面超越傳統的檢測方法仍存在一定距離，但隨著研究的不斷深入，我們有望開發出更多類型的CRISPR/Cas體系，將它們更廣泛地應用在病原微生物的檢測中。
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參考文獻
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