慢性同種異體移植功能障礙（CAD）是導致同種異體腎移植損失的主要原因，其組織學特征為間質纖維化和腎小管萎縮。通過snRNA-seq和轉錄組分析，確定了CAD腎同種異體移植中纖維化形成細胞的起源、功能異質性和調控。從腎移植活檢中分離單個細胞核，并成功地分析了來自5名CAD腎移植受者的23,980個細胞核和來自3名正常同種異體移植功能患者的17,913個細胞核。揭示了兩種不同的CAD纖維化狀態；低和高細胞外基質(ECM)具有不同的腎細胞亞群，免疫細胞類型和轉錄譜。大量細胞分析證實蛋白水平ECM沉積增加。近端腎小管細胞轉變為損傷的混合腎小管（MT1）表型，由活化的成纖維細胞和肌成纖維細胞標記物組成，產生臨時的ECM，激活炎癥細胞，并作為纖維化的主要驅動因素。高ECM狀態的MT1細胞實現了復制性去分化和腎源性轉錄信號的修復。低ECM狀態下的MT1顯示細胞凋亡減少，循環小管細胞減少，以及嚴重的代謝功能障礙，限制了修復的潛力?；罨腂、T和漿細胞在高ECM狀態下增加，而巨噬細胞亞型在低ECM狀態下增加。移植后數年檢測到腎實質細胞和供體來源的巨噬細胞之間的細胞間通信，在損傷的增殖中起著關鍵作用。因此確定了新的分子靶點，旨在改善或防止腎移植受體的同種異體移植纖維生成。

使用Banff標準，活檢樣本被分類為IFTA或正常/非特異性。41,893個單核的UMAP整合產生了18個主要的細胞簇。在纖維化和正常之間的1755個差異表達基因中，1006個DEG在纖維化中上調，118個與人類核心基質數據庫重疊。在纖維化同種異體移植活檢中，除了免疫細胞的不同類型和轉錄譜外，還鑒定了ECM基因譜的定性和定量差異。纖維化活檢分為兩種狀態，低ECM和高ECM。核心染色體基因在高ECM狀態下比低ECM狀態下更豐富。FN1、COL1A1和VCAN在高ECM中存在差異表達。為了驗證蛋白水平上的基因表達，腎活檢的成像細胞計數(IMC)證實了ECM沉積的存在和水平。COL1A1和VIM的表達從正常<低ECM<高ECM增加。GO分析顯示，高ECM中炎癥反應上調，與較高比例的免疫細胞相一致。纖維化中上調基因的通路和富集分析在細胞形態發生、傷口愈合和上皮細胞分化中具有重要意義。

2. 移植腎的細胞分布

近端腎小管(PT)細胞在正常腎移植物中大量存在。與正常移植物相比，高ECM組PTs顯著降低，低ECM組PTs略有降低。與正常移植物相比，兩種纖維化狀態下成纖維細胞(FB)亞簇FB1升高。內皮細胞(EC)亞簇EC2在高ECM狀態下更為豐富。與正相比，混合管狀(MT)亞簇MT1在纖維化中的比例過高。免疫細胞從正常到低ECM到高ECM顯著增加。低ECM和高ECM顯示了不同的氧化石墨烯富集項和途徑。KCNIP4在纖維化狀態特異性的小管簇中上調。KCNIP4在促炎、促纖維化狀態下上調，這種狀態在急性腎損傷后持續存在。低和高ECM狀態表現出不同的細胞分布和轉錄譜，支持纖維化狀態的異質性。

2. 小管上皮細胞損傷和移植物纖維化

兩種纖維化狀態下PT生理通路均下調。脂質和脂肪酸代謝改變在低ECM中更為顯著。細胞周期阻滯與腎損傷有關，在腎小管細胞保護和不適應修復中起著重要作用。所鑒定的小管細胞簇(PT, MT1, MT2)在三組之間存在與細胞循環比例相關的差異，與正常相比，低ECM時略有下降，高ECM時略有增加。與高ECM和正常ECM相比，低ECM顯示G2M細胞周期調節因子的表達減少。同種異體纖維化移植物的DEG分析顯示，MT1過表達的基因富集于肌動蛋白絲基礎過程、細胞形態發生、受體酪氨酸激酶和VEGF信號傳導。高ECM的特征是細胞形態發生、白細胞分化和WNT信號傳導。

在纖維化同種異體移植物中，MT1下調氨基酸降解，高ECM中T細胞的活化和分化富集。MT1是上皮細胞向間質轉化(EMT)的中間轉錄狀態。對于正常移植物，細胞軌跡終止于FB1，而纖維化移植物的軌跡延伸至FB2簇。這些離散的偽時間軌跡表明，基因表達的變化說明了兩種不同的FB譜系起源于并結束于PT，導致從PT到FB2集群的功能轉變。轉錄組學分析顯示，MT1共表達PT和損傷25個marker。高ECM狀態下的MT1表達更高水平的損傷marker。移植物損傷和正常PT標記物的正常表達可能是持續的亞臨床免疫反應和慢性暴露于鈣調磷酸酶抑制劑的結果。在高ECM的MT1中，增殖標記物(MKI67)和凋亡標記物(CASP3)的共同上調，受損PT細胞亞群經歷了損傷誘導的復制。與低ECM和正常相比，高ECM MT1的SLC34A1表達減少，表明損傷的PT細胞去分化。在早期腎臟發育期間正常表達的腎源性特征與高ECM相關，而在低ECM中沒有觀察到。MT2細胞不像MT1細胞那么豐富，主要存在于正常的同種異體移植物中。

3. 腎移植物中的成纖維細胞亞型

鑒定出兩種不同的成纖維細胞簇(FB1, FB2)。FB1在纖維化腎臟中更豐富，富含肌成纖維細胞標記物。低ECM中FB1的GO分析顯示細胞連接、局灶黏附和VEGF信號通路上調，而高ECM中ECM組織、平滑肌收縮和傷口愈合上調。FB2在高ECM中占主導地位，由PDGFR-β表達定義，并在周細胞標記物中富集。FB2相關信號通路包括RhoA、NOTCH和整合素激酶信號。在高ECM中，FB2通路與肌動蛋白絲為基礎的過程、局灶黏附以及細胞運動和黏附的正向調節有關。FB1-2在高ECM中比低ECM中轉錄活性更強。譜系圖譜分析確定了FB在正常和纖維化狀態下的重編程軌跡。正常移植物中的FBs沿偽時間軌跡是均勻的，而纖維化移植物中的FBs則是不均勻的。這一數據支持FB在纖維化移植物中的功能表型轉變。

4. 衰竭腎臟的免疫系統

總共分析了2,655個免疫細胞，并在研究組中確定了12個免疫亞群。正常同種異體移植物的免疫細胞最少。低ECM的骨髓細胞比例最高，包括各種巨噬細胞(MΦ1, MΦ2)，經典和漿細胞樣樹突狀細胞(cDC, pDC)和肥大細胞。高ECM的B細胞、血漿細胞、T細胞和Treg細胞比例最高。免疫細胞(T (CD4+， CD8+)， B (CD20+)和MΦ (CD68+))的相對比例和空間分布通過福爾馬林固定石蠟包埋活檢的IMC染色進行評估。

高ECM的T細胞簇富集了與B和T細胞活化、NF-kB信號、TCR信號和Th17細胞分化相關的DEGs，這與MT1簇富集的活性增加相匹配。B細胞通路相關基因包括B細胞活化、白細胞趨化、內吞作用以及NF-kB和FC受體介導的刺激信號通路的調控。高ECM的漿細胞具有活躍的轉錄譜。

鑒定出三個巨噬細胞簇(MΦ1-3)，并以常見的巨噬細胞標志物(CSF1R, MANBA, PLXDC2, RTN1, GRK3)為特征。MΦ1s通過抗原加工和遞呈上調、HLA II類基因上調和Th1/Th2/Th17細胞分化進行分類。MΦ2s(以STAB1, F13A1, CD163, NRP1為特征)顯示MHC ii類介導的抗原呈遞和巨噬細胞M2相關的吞噬。MΦ1-2在高ECM腎移植物中也過表達CD74。

低ECM擁有最大的MΦ1和MΦ2群。在兩種纖維化狀態下，MΦ2的表達譜與細胞粘附和內吞作用調節有關，而IFN-α和-γ反應是高ECM所特有的。

使用三組性別不匹配病例的XY染色體相關基因表達特征來評估供體與受體免疫細胞對同種異體移植物的貢獻。免疫細胞主要來自受體，小部分來自供體。沒有證據表明受體存在非免疫細胞。對于一些樣本，根據性別特異性基因的表達將免疫細胞群分為供體/受體特異性免疫細。移植后60個月，供體免疫細胞在腎移植中被鑒定出來。對樣本KUT040中特定細胞類型的供體和受體標記的免疫細胞之間的DEGs進行了評估。這項原理驗證分析顯示，基于供體/受體來源的免疫細胞的差異貢獻，支持常駐巨噬細胞在腎移植中介導和加劇免疫介導的炎癥中的重要作用。

5. 纖維化過程中的旁分泌信號

配體受體(LR)分析集中在細胞比例有顯著差異的簇上，并在腎纖維化中具有重要意義。它們的成纖維細胞受體具有共同的功能作用，包括成纖維細胞激活和ECM擴展。

PDGFC是一種強效的促纖維化絲裂原，在纖維化移植物中分泌，支持成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉分化。NOTCH信號通路的上調也是共有的。TLRs通過DLL1觸發巨噬細胞中的NOTCH信號，DLL1是高ECM分泌的主要NOTCH配體。對于低ECM, FB1-MΦ3 LRs也參與PI3K-Akt-mTOR信號傳導。對于低ECM, MT1-MΦ3和MT1-MΦ1 LRs參與趨化性和管狀/組織形態發生。細胞極性調節劑CELSR1-PSAP和成纖維細胞增殖和激活調節劑FGFR2-MAPK1等相互作用進一步支持低ECM中的EMT。在高ECM中，MT1-MΦ1(和FB1-MΦ1)相互作用反映了細胞因子介導的和NIK/NF-kB信號通路，與增加的免疫細胞豐度和激活一致。H&E和IHC染色進一步證實了LR與浸潤細胞和受損腎臟結構的相互作用。低ECM腎實質顯示纖維化斑塊，而高ECM顯示更緊密的纖維化區域。間質間存在和相對豐富的肌成纖維細胞在纖維化發病過程中起著關鍵作用。