前言：

我們知道，細胞體外培養時需要在培養基中加入血清，以維持細胞的生長和存活。而血清，尤其是牛血清，因成分復雜、批間差大和存在病原體污染的可能性等原因廣為科研和生物制藥用戶所詬病，因此人們對不添加血清的培養基，即無血清培養基的需求日益增加。無血清培養基中不含血清，為能夠實現與含血清培養基相似的維持和促進細胞生長的功能，其中必須添加白蛋白(Albumin)、胰島素(Insulin) 和轉鐵蛋白(Transferrin)等營養成分來替代血清。

白蛋白可與維生素(如VB6)，脂肪酸(如油酸、亞油酸和花生四烯酸等)，以及離子(如銅離子)等結合，提高這些分子在細胞培養液中的溶解度，并使它們保持在穩定狀態，以及防止被氧化。

胰島素可維持無血清細胞培養液中細胞的生長，調節細胞對葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的攝取、利用和貯存，同時抑制糖原、蛋白質和脂肪的分解。胰島素也具有對抗細胞凋亡的作用。

轉鐵蛋白則是通用的鐵轉運劑，其可通過幫助細胞調節對鐵的攝取量而維持細胞的穩態，進而有利于細胞的生長和增殖。

本文將對無血清培養基添加物：胰島素，胰島素的類似物--長型胰島素樣生長因子(Long R3 IGF-I)，和轉鐵蛋白作以簡單介紹和初步探討，以期為配制無血清培養基提供一些思路。

第一部分：胰島素(Insulin)

1. 什么是胰島素?

胰島素的英文名為Insulin，是由加拿大人弗雷德里克?格蘭特?班廷爵士(Sir Frederick Grant Banting)和查爾思?貝斯特(Charles H Best)于1921 年發現的，因其特異性由胰島β細胞分泌而得名。胰島素的發現為人類治療糖尿病帶來了福音。

胰島素是一種多肽類激素，由A、B 兩條肽鏈組成。人胰島素的A 鏈和B 鏈分別含21個氨基酸和30 個氨基酸，其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，將A、B 兩條鏈連接起來。

胰島素基因位于染色體11P15.5，含3 個外顯子和2 個內含子。生物合成時，編碼胰島素的基因在胰島β 細胞的細胞核中先轉錄成446 bp 的mRNA，然后翻譯成由105 個氨基酸相連的長肽，即前胰島素原。前胰島素原經過蛋白水解作用將前肽切除,生成由86 個氨基酸組成的長肽鏈--胰島素原。胰島素原在高爾基體中經蛋白水解酶的作用，切去第31、32 和60 位三個精氨酸連接的鏈，形成由A 鏈和B 鏈組成的胰島素，然后分泌到胰島β 細胞外，進入血液循環。

胰島素的體外獲得主要有提取和基因重組兩種方式，人工合成胰島素則是由中國科學家在1965 年首先實現的，當時合成出具有全部生物活力的結晶牛胰島素，這也是第一個在實驗室中用人工方法合成的蛋白質。

2. 胰島素在無血清培養基中的作用

無血清或低血清培養基中，胰島素為必加組分，這是由胰島素對細胞的重要作用決定的。我們都知道，胰島素在體內最主要的功能是調節機體血糖水平。其實胰島素的作用非常廣泛，包括調節蛋白質和脂肪的代謝，以及促進細胞生長等。

胰島素功能的發揮源于其對細胞的作用，進而引起組織乃至機體的整體反應。我們可將胰島素在細胞水平的廣泛作用分為三大類：代謝作用、促生長作用、以及代謝和促生長混合作用(表1)。

與其他肽類激素、細胞因子以及神經遞質相似，胰島素首先與細胞膜上的特異性受體結合，然后啟動各種生物學效應[圖2] 。比較特殊的是，胰島素的受體并不僅僅存在于特異性的靶組織，即胰島β細胞上，而是普遍存在于幾乎所有哺乳動物細胞上，只是不同細胞上胰島素受體的數量會有差異。因此，胰島素可被用于幾乎所有細胞的無血清培養基的配制中。

圖2：胰島素與細胞膜上受體的相互作用及生物學效應

(摘自文獻Kahn CR. Annu Rev Med. 1985;36:429-51[1])

需要注意的是，胰島素對細胞的代謝調節作用主要是通過其與細胞膜上的胰島素受體(Insulin receptor, IR)相互作用而介導，而胰島素對細胞的促生長作用則是通過其與細胞膜上胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factors, IGFs)的受體，即IGF Receptor (IGFR)相互作用而介導的。

3. 無血清培養基中應該添加提取的胰島素，還是重組的胰島素?

人胰島素的來源有限，無法滿足臨床和科研的需求，因此人們通常從牛或豬的胰臟中提取獲得胰島素。

胰島素種屬間高度保守，豬和牛的胰島素與人的胰島素氨基酸序列上分別僅有1個和3個氨基酸的差異，所以豬和牛的胰島素完全可以替代人的胰島素來進行科學實驗和臨床治療。

然而，畢竟豬和牛的胰島素屬異種蛋白，進入人體后容易產生抗體，影響治療效果，并引起副反應。所以，目前臨床上廣泛應用的是重組人胰島素，即使用基因工程手段，將人的胰島素基因轉移到細菌或者酵母細胞中，然后利用發酵工藝，進行大規模的生產，從而得到大量、高純度的人胰島素。

從表2 可以看出，提取的胰島素可能含有其它激素等雜質，并可能因其異源性而導致在人體內產生抗體。所以，在配制無血清培養基時最好使用重組的人胰島素，這樣：

1) 如果此無血清培養基用于科學研究，不會因含有胰島素以外的激素而引起與預期結果不符的反應；

2) 如果此無血清培養基用于細胞治療，因無異源性，細胞體外培養后回輸到人體時不會產生抗體，也就不會影響治療的效果。

4. 無血清培養基中應該添加試劑級別的重組人胰島素，還是藥物級別的重組人胰島素?

因為胰島素具有治療糖尿病的重要功效，所以多年前就已被制備成藥品，以供糖尿病患者的使用。

藥品確實具有制備嚴格(多數遵循GMP 標準生產)，副作用和安全風險小等優點，因此許多無血清培養基生產廠家傾向于使用藥物級別的胰島素。然而，仍有不少廠家在使用試劑級別的重組人胰島素來生產無血清培養基。

那么，無血清培養基究竟是該用試劑級別的重組人胰島素，還是藥物級別的重組人胰島素呢?

藥品與試劑不同，藥品有不同的劑型，如片劑、針劑、膠囊劑和栓劑等十多種。即使對于同一種劑型，其中還可分為若干亞型，如針劑包括注射水針劑、注射油針劑、中草藥注射劑，以及注射用滅菌粉末等。而且藥品通常保存于室溫或2 - 8°C。這就要求藥品在制備過程中除了包含藥物本身(通常稱為主藥)外，還必須加入一些有助于制劑成型(如賦形劑)、穩定(如抑菌劑)、增溶和助溶等具有不同作用的輔料，也就是說藥品中含有很多非藥品成分。將藥品添加入無血清培養基中進行細胞培養時，不可避免地會引入諸多不確定的因素，一方面可能會對細胞的生長或分化產生影響，另一方面可能會帶來非預期的實驗結果。而藥物輔料對培養細胞的作用又很難通過設立輔料對照來確定，因為輔料的成分過于復雜，且通常藥廠并不公開輔料的具體組分。

下面我們以藥物級別的重組人胰島素為例來看一下輔料對體外細胞培養的可能影響。

從上表可以看出，胰島素藥物中的輔料均具有一定的負面生物學功能，這些功能在藥物用于人體內治療時不會顯現，因為人體具有肝臟等解毒器官，低濃度的有害物質短期內不會對人體的組織產生影響。但當藥物用于體外細胞培養時，因為藥物中的輔料會直接、完全地作用于細胞，這些輔料的副作用更容易顯現出來。雖然當藥物加入細胞培養體系時，輔料的濃度可能已經降得很低，但不排除這些輔料或多或少仍會對細胞的生長或分化產生某些影響。

另外，無血清培養基體系中所必須添加的組分-白蛋白(albumin) 與胰島素藥物中的輔料-苯酚和間甲酚會形成沉淀，從而在一定程度上影響白蛋白的功能。其實，已經證實苯酚的衍生物- 酚紅(phenol red) 有干擾某些細胞的克隆性生長的作用，所以用于培養干細胞或生長密度比較低的細胞的無血清培養基中通常不添加酚紅，盡管培養基中因此會缺少酸堿指示劑。

綜上所述，配制用于體外細胞培養的無血清培養基最好使用不含任何輔料的試劑級別胰島素，以避免輔料可能給細胞帶來的危害以及實驗結果不確定性的增加。

5. 胰島素在無血清培養基中的使用濃度

所培養的細胞不同，無血清培養基中所需的胰島素量也有所區別，一般在1-10mg/L之間。

藥物級別的胰島素一般以IU(International Units)，即國際單位來表示其中胰島素的含量。如果原來在無血清培養基中添加的是藥物級別的胰島素，現在想轉換成試劑級別的胰島素，么應該在每L 培養基中加入多少mg 的胰島素呢？

藥物胰島素的一個IU 相當于6nmol，即0.035mg 的胰島素。以禮來公司的優泌林70/30(Humulin 70/30) 400U/10mL 胰島素為例，如果在配制某種無血清培養基時，每L 加入10U，那么轉換為使用試劑級別的胰島素時，則每L 需加入：10 x 0.035mg = 0.35mg 的試劑級別胰島素。

第二部分：Long R3 IGF-I 優于胰島素和IGF-I

1. IGF-I與胰島素

IGF-I 是IGFs 的一種。IGFs 的英文全稱是Insulin-like growth factors，即胰島素樣生長因子，因其可模擬胰島素對細胞的全部生物學效應而得名。

IGFs 與胰島素在功能上基本相同，但胰島素主要作用于細胞的代謝，而IGFs 主要作用于細胞的生長。

IGFs 包括IGF-I 和IGF-II 兩種低分子量多肽，分別由70 和67個氨基酸組成，兩者氨基酸的一致性為62%，與胰島素有約50%的氨基酸是一致的。

在無血清培養基的配制中，常用IGF-I 來替代胰島素，原因是IGF-I 在很低的濃度即可實現或超過遠遠高于生理濃度的胰島素的促細胞生長作用。

2. 什么是Long R3 IGF-I?

Long R3 IGF-I 是人IGF-I(胰島素樣生長因子-I)的重組類似物。

從結構上來講，Long R3 IGF-I 可稱為長型IGF-I，因為其是將IGF-I 全長氨基酸序列的第3 位谷氨酸(G)變為精氨酸(R)，并在N 端添加一段長為13 個氨基酸的肽鏈。由此可知，Long代表N 端加長，而R3 代表第3位氨基酸變為精氨酸(R)。

從效用上來講，Long R3 IGF-I 可稱為長效IGF-I，因為與胰島素相比，Long R3 IGF-I添加到無血清培養基中后不容易被降解，所以作用更持久。

3. Long R3 IGF-I與胰島素、IGF-I 的比較

4. Long R3 IGF-I優于胰島素

1) 促細胞增殖能力更強

從表5 和圖4 可以看出，細胞表面的胰島素受體(Insulin Receptor，IR)主要介導對細胞的代謝調節作用，而IGF-I 受體(IGF-I Receptor，IGF-IR)主要介導促細胞生長作用。

圖4：胰島素和IGF 與受體的結合及產生的生物學效應

(摘自文獻Kahn CR. Annu Rev Med. 1985;36:429-51[1])

與胰島素的受體相似，IGF-I 的受體也存在于大多數細胞的細胞膜上，因此多數情況下，同一細胞上會既存在胰島素的受體，又存在IGF-I 的受體。更需注意的是，胰島素和IGF-I 除可與各自的相應特異性受體， IR和IGF-IR結合并介導相應的生物學效應(分別為代謝調節和促生長作用)，也可與對方的受體結合，即胰島素可以與IGF-IR結合，介導促細胞生長和增殖作用，而IGF-I 也可與IR 結合，介導對細胞代謝的調節作用，只是與相應特異性受體結合的親合力很高，而與對方受體結合的親合力很弱，也就導致胰島素和IGF-I 通過特異性受體產生的生物學效應較強，而通過對方受體產生的生物學效應較弱。總結如下：

a. 胰島素的主要作用是調節細胞的代謝，雖然也具有促進細胞生長作用，但較弱，這也正是在無血清培養基中需要添加遠高于生理濃度的胰島素（高于生理濃度100 倍之多，濃度一般為1 - 10mg/L）才能維持細胞生長的原因。

b. IGF-I 的主要作用是促進細胞生長，也具有調節細胞代謝的作用，但較弱。因此，很低濃度的IGF-I(10 -100μg/L) 即可維持無血清培養液中細胞的生長。

此外，有些細胞，如CHO(中國倉鼠卵巢細胞)等細胞上，IR 的數量很少，而IGF-IR的數量較多(表6)，因胰島素是通過與IGF-IR 結合來發揮促細胞生長作用的，所以如果無血清培養基中添加的是胰島素，即使所用的胰島素濃度再高，因其與IGF-IR受體的親合力較弱，仍無法達到與IGF-I 等同的促細胞生長效應。此時的最佳策略是直接在無血清培養基中添加IGF-I ，這樣細胞的生長會得到非常好的維持，而且IGF-I 的使用濃度也很低。

Long R3 IGF-I 是在全長IGF-I 的基礎上重組表達而得的，因此與IGF-I 受體的特異性結合能力不比IGF-I 差，產生的生物學效應也相同。對于某些細胞，在無血清培養基中添加Long R3 IGF-I 的劑量即使僅為胰島素的1/200，也可實現遠好于胰島素的促進細胞生長和增殖作用。

2) 細胞密度更高，細胞活力更好

工業級別細胞培養一般是在生物反應器中進行的，其中，應激(stress)誘導的凋亡是細胞喪失活力的主要原因。Long R3 IGF-I 通過活化IGF-IR 受體可引起多個信號轉導通路的激活，這對細胞的存活和增殖至關重要。與胰島素相比，Long R3 IGF-I 對IGF-IR 的活化能力更強，其激活某些關鍵抗凋亡和增殖信號分子(如Akt 和MAPK 等) 的能力也更強。這些信號分子的激活可防止因培養條件和環境的變化而引起的細胞活力喪失。

因此，與胰島素相比，添加Long R3 IGF-I 的無血清細胞培養基所培養出的細胞密度更高，活細胞數更多。

3) 提高重組蛋白或抗體的產量

從第1)和第2)點可以看出，用Long R3 IGF-I 培養的細胞增殖能力強，活細胞數目多，所以用添加Long R3 IGF-I 的無血清細胞培養基培養表達重組蛋白或抗體的細胞時，通常會比用添加胰島素的無血清細胞培養基培養獲得更高產量的重組蛋白或抗體。

也就是說，如果目的是生產重組蛋白或抗體，最好用添加Long R3 IGF-I 的無血清細胞培養基來優化一下生產流程，有可能會使生產效率得以明顯提高。

4) 培養液中半衰期更長，生物活性更長效

細胞在培養過程中會內化培養液中所添加的生長因子，同時也會分泌一些酶到培養基中，引起生長因子的降解。與胰島素相比，Long R3 IGF-I 更加穩定，被細胞內化和酶降解的速度較慢，因此其在培養體系中的半衰期更長，生物學活性發揮更持久，細胞的培養效果也更好。

在正常的細胞培養條件下，Long R3 IGF-I 比胰島素的有效作用時間最長可延長2倍之多，因此Long R3 IGF-I 又可稱為長效IGF-I。

5. Long R3 IGF-I優于IGF-I

Long R3 IGF-I 是以IGF-I 為基礎改造而來，即IGF-I 的氨基酸序列中第3 位谷氨酸(G)被精氨酸(R)所取代，而且在氨基末端加了一個13 個氨基酸的延長肽。改造后，Long R3IGF-I 仍具有高親合力結合IGF-IR 的能力，因此保持著與IGF-I 相似的促細胞增殖活性。同時，改造給Long R3 IGF-I 帶來一個非常顯著的優點，即與IGF 結合蛋白(IGF Binding Proteins, IGFBPs)的親合力明顯下降。

所有哺乳動物細胞均會分泌IGFBPs，后者可結合并抑制IGF-I 的活性，而改造后的Long R3 IGF-I 與IGFBPs 的親合力比其原型分子IGF-I 下降1000 多倍，因此其活性可極大程度地避免被IGFBPs 所抑制，從而使得Long R3 IGF-I 在培養體系中的生物可利用度和活性較IGF-I 大為提高。

綜上所述，Long R3 IGF-I 是IGF-I 的升級版本，具有諸多重要的優點，原來添加胰島素或IGF-I 的無血清培養基可嘗試使用Long R3 IGF-I，或許會獲得更好、更穩定的細胞培養效果。

第三部分：轉鐵蛋白(Transferrin)

1. 什么是轉鐵蛋白?

轉鐵蛋白的英文名為Transferrin，簡稱TF，是血漿中主要的含鐵蛋白質，負責運載由消化管吸收的鐵和由紅細胞降解釋放的鐵。以三價鐵復合物的形式進入骨髓中，供成熟紅細胞的生成。

轉鐵蛋白是機體不可或缺的蛋白，其不僅參與鐵的運輸與代謝，從而調節鐵離子平衡和能量平衡，還參與呼吸、細胞增殖和免疫系統的調節，更具有抗菌殺菌的保護功能。

轉鐵蛋白主要存在于血漿中，在網狀細胞、胎盤、粘膜、卵巢、睪丸和中樞神經系統中也有存在。血漿中的轉鐵蛋白供應機體絕大部分組織的鐵，而在其不能到達的部位，如卵巢、睪丸和中樞神經系統等，則由這些組織自己合成的轉鐵蛋白在局部產生轉鐵作用。

轉鐵蛋白于1945年首先在人血清中發現，后在豬等哺乳動物以及魚類、兩棲類和爬行類的血清中也有發現。雖然不同種屬的轉鐵蛋白間差別較大，但其氨基酸序列上有很強的保守性。

人類轉鐵蛋白由兩個結構相似的分別位于N-端和C-端的球形結構域組成，為單一糖蛋白肽鏈，共含678個氨基酸殘基，分子量約為80kD，等電點為5.9。每個轉鐵蛋白分子能可逆性地結合兩個三價鐵離子(Fe3+)。

人轉鐵蛋白的基因位于第3號染色體q21-25上，含17個外顯子和16 個內含子，mRNA長2318 bp。血漿轉鐵蛋白主要在肝臟合成，最初合成的轉鐵蛋白被蛋白水解酶分解，去掉19-22個氨基酸后方能成為成熟的轉鐵蛋白。

轉鐵蛋白對細胞發揮的作用是通過與其受體，即Transferrin Receptor(TfR)相互作用而實現的。TfR 是一種表達于細胞表面的糖蛋白，由兩個同源二聚體的亞基通過二硫鍵連接而成。如圖6，胞外負載有兩個三價鐵離子(Fe3+) 的轉鐵蛋白(Fe2 -Tf ) 與細胞(如骨髓中的網織紅細胞)表面的TfR 結合，藉受體介導的內吞作用進入細胞的內體(endosome)中。內體在膜質子泵的作用下酸化，其內pH 值會下降到5.5，轉鐵蛋白兩個小亞基上的賴氨酸(209 位和301 位)被酸化，啟動雙賴氨酸開關機制，迫使兩個小亞基分開并釋放出Fe3+，然后在還原酶的作用下，Fe3+被還原成Fe2+，再由膜二價金屬轉運體DMT1 轉運至細胞質。釋放了Fe3+的脫鐵轉鐵蛋白與其受體組成的復合物經胞吐作用回游到細胞質膜。在細胞外，轉鐵蛋白與其受體解離，成為游離的脫鐵轉鐵蛋白(Apo-Tf)，然后可再與Fe3+結合后重新參與鐵循環。細胞內的Fe2+被血紅素、細胞色素等結合或被鐵蛋白螯合作為儲備鐵備用[7]。

圖6：轉鐵蛋白循環

2. 轉鐵蛋白在無血清培養基中的作用?

牛血清中含有牛種屬的轉鐵蛋白，由于轉鐵蛋白的保守性，牛轉鐵蛋白可對人和動物細胞起到很好地保護和支持作用，因此培養基中通常要加入牛血清從而組成完全培養基。無血清培養基為達到與含血清培養基相同或相似的細胞培養性能，其中也必須添加轉鐵蛋白，以實現對細胞鐵離子平衡的調節，以及對細胞生長和增殖的維持。

轉鐵蛋白在無血清培養基中具有非常重要的作用，具體包括：

1) 避免細胞外環境中自由基的產生，防止細胞受到傷害

我們知道，自由基對細胞膜、蛋白質和DNA 均有較大的損傷作用。如果細胞培養基中出現過多的自由基，被培養的細胞則容易受到傷害，而鐵正是形成自由基的罪魁禍首之一。

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + ?OH

從上面的反應式可以看出，Fe2+能使過氧化氫(H2O2)還原生成羥基自由基(?OH)，而羥基自由基是最為活躍和作用最強的氧自由基，對細胞的傷害很大。

轉鐵蛋白可以與鐵離子高親合力結合，當被添加入無血清培養基后，在細胞外的培養環境中基本不會存在游離的鐵離子，也就不會發生自由基反應，故可避免自由基對細胞的損傷。

2) 維持細胞的生長和增殖

我們對轉鐵蛋白的轉鐵作用都很了解，但其實轉鐵蛋白更重要的意義在于維持細胞的生長和增殖，也就是說，轉鐵蛋白有類似于生長因子的功能。

那么轉鐵蛋白是如何發揮維持細胞生長和增殖的作用呢？其實這還是與其轉鐵功能密切相關。

我們知道，細胞內有很多重要的蛋白(見表7)需要結合鐵離子后才能發揮其活性，這些蛋白基本上都與DNA 的復制和修復，以及DNA 的穩定性有關，也就是說它們影響著細胞的生長和增殖。

轉鐵蛋白通過與其在細胞表面的受體結合，將鐵離子轉運并釋放到細胞內后，這些鐵離子會與上述需鐵蛋白結合，然后發揮后者維持細胞生長和增殖的功能。如果無血清培養基中不含轉鐵蛋白，細胞內的需鐵蛋白將無法獲得鐵離子，因而會失去活性，導致細胞生長停滯或死亡。

3) 維持細胞內的鐵平衡

轉鐵蛋白的這個功能也很重要。對于細胞而言，并不是鐵越多越好，而應當是在適當的時間獲得適量的鐵。如果細胞內的鐵過多，也跟細胞外環境一樣，鐵會誘導產生破壞力極強的羥基自由基。而如果細胞內鐵過少，則不足以維持細胞的生長和增殖。

那么轉鐵蛋白是如何調節細胞內的鐵平衡的呢？這與細胞表面的轉鐵蛋白受體有關。

細胞表面轉鐵蛋白受體的數目不是固定不變的，而是隨著細胞對鐵的需求程度而上調或下調，因而可自主影響細胞對鐵的攝取量。

一般而言，靜止未活化的細胞表面轉鐵蛋白受體相對較少，而活化增殖的細胞表面轉鐵蛋白受體數目顯著增加。如淋巴細胞在有絲分裂因子的刺激下會發生轉化，在DNA 合成前數小時，轉鐵蛋白受體的數目明顯上調，鐵攝入也相應增加。而到了有絲分裂期，淋巴細胞表面轉鐵蛋白受體數目又明顯減少，這時細胞對鐵的需求量也降低了。腫瘤細胞均為快速增殖的細胞，所以相對于正常細胞，腫瘤細胞表面存在著大量的轉鐵蛋白受體，以滿足腫瘤細胞對鐵的大量需求[8]。

此外，在細胞培養中，轉鐵蛋白受體數目與培養環境中鐵的含量也密切相關。培養環境中的含鐵介質比較多，則細胞表面轉鐵蛋白受體的數目會減少，從而避免細胞攝入過量的鐵[8]。既然轉鐵蛋白的作用僅是向細胞內轉運鐵離子，然后通過鐵離子來發揮維持細胞生長和增殖的作用，于是有研究者試圖在無血清培養基中加入鐵離子螯合劑，以將鐵離子轉運到細胞內，從而供細胞的生長所需，這樣可以避免使用轉鐵蛋白，使配制出無蛋白成分的無血清培養基成為可能。鐵離子螯合劑雖然也取得了部分成功，但對于絕大多數細胞并不能很好地維持細胞的生長，原因是鐵離子螯合劑只有轉鐵作用，但無調節鐵平衡的能力，常會導致細胞內的鐵含量過多，進而產生自由基并使細胞受到損傷[9,10]。

3. 無血清培養基中應該添加提取的轉鐵蛋白，還是重組的轉鐵蛋白?

人血漿中轉鐵蛋白的含量豐富，約為25mg/ml，占血漿總蛋白的4%，而且轉鐵蛋白的種屬間交叉活性比較強，所以轉鐵蛋白多從人或牛的血漿中提取而得。

但提取的轉鐵蛋白具有安全性差和批間差大等缺陷(表4)。尤其是將提取的轉鐵蛋白添加于用于細胞治療的無血清培養基中時，可能會將人或動物的病原體（如瘋牛病病毒，克雅氏病毒和其它未知病原體）藉回輸人體的細胞而帶入人體，從而發生非預期的疾病。而重組的轉鐵蛋白，則可完全避免人或動物病原體污染的可能性，因此更適合用于配制細胞治療用的無血清培養基。

4. 無血清培養基中應該添加鐵飽和(Holo)的轉鐵蛋白，還是脫鐵(Apo)的轉鐵蛋白?

我們知道，一個轉鐵蛋白可以高親合力結合2 個Fe3+。結合了2 個Fe3+的轉鐵蛋白，因其鐵離子結合位點均已被占用，所以稱為鐵飽和轉鐵蛋白，英文為Holo-transferrin，holo是全部、完全的意思。而未結合Fe3+的轉鐵蛋白則稱為脫鐵轉鐵蛋白，英文為Apo-transferrin，其中Apo 是分離的意思。

重組的轉鐵蛋白最初均為Apo-transferrin，要得到Holo-transferrin 則需在酸性環境下與一定量的六水硫酸鐵銨作用，然后再將pH 值調至堿性，再作用一段時間即可。體外細胞培養時，Apo-transferrin 與細胞表面轉鐵蛋白受體的親合力很弱，但當其結合細胞外環境中的Fe3+形成Holo-transferrin 后，與細胞表面轉鐵蛋白受體的親合力顯著提高，進而介導了對鐵的轉運。

那么在配制無血清培養基時，是應該添加Holo-transferrin 還是Apo-transferrin 呢?

無血清培養基中多數都添加Holo-transferrin，因為Holo-transferrin 除發揮轉鐵作用外，自身即可作為細胞的鐵源，無需在培養基中另加外源性鐵。但在某些本身含鐵量高的培養基(如DMEM/F12)中，則可使用Apo-transferrin 這種不含鐵的轉鐵蛋白。

另外需要注意，通常我們無法從理論上推斷出到底是Holo-transferrin 好還是Apotransferrin好，最準確的方法是進行實驗測試。

有報道在神經細胞無血清培養時，添加物B27與Holo-transferrin 合用會比與transferrin合用獲得更好的神經元培養質量[11]。而另一種添加物N2，與Apo-transferrin合用時則會提高某些神經干細胞的增殖能力。

5. 轉鐵蛋白在無血清培養基中的使用濃度

細胞種類不同，對轉鐵蛋白的需求量也不同，下表謹供參考。具體的濃度還是要根據細胞的種類、狀態和想要實現的功能來通過實驗確定。

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附錄：