Western實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需經(jīng)過“轉(zhuǎn)膜”步驟，從PAGE膠轉(zhuǎn)移到膜上固定，才能用各種方法進(jìn)行Western Blot的檢測和顯示，而且為了防止沒有電場的情況下已經(jīng)分離的蛋白條帶擴(kuò)散，轉(zhuǎn)膜要盡快進(jìn)行。轉(zhuǎn)膜是對Western最終結(jié)果影響最大的一步，轉(zhuǎn)膜質(zhì)量的好壞直接決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞。下面介紹一些實(shí)用技巧，趕緊Get起來吧。
1. 膜的選擇
膜的選擇主要從實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)要求來考慮，例如做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的膜是不可取的，因?yàn)榭赡軙沟玫鞍滓蛲高^膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白含量不確定，從而影響最終結(jié)果的可靠性。通常小于20KDa的蛋白選擇0.2um的膜，而大于20KDa的蛋白選擇0.45um的膜。常見的膜有NC膜和PVDF膜，區(qū)別如下：
| |
NC膜 |
PVDF膜 |
| 靈敏度和分辨率 |
高 |
高 |
| 背景 |
低 |
較高 |
| 結(jié)合能力 |
80-110ug/cm2 |
125-200ug/cm2 |
| 材料質(zhì)地 |
干的NC膜易脆 |
機(jī)械強(qiáng)度高 |
| 溶劑耐受性 |
無 |
有 |
| 操作程序 |
緩沖液潤濕，避免氣泡 |
使用前100%甲醇潤濕 |
| 檢測方式 |
常規(guī)染色，可用放射性和非放射性檢測 |
常規(guī)染色，可用考馬斯亮藍(lán)染色，
ECL檢測，快速免疫檢測 |
| 價(jià)格 |
較便宜 |
較貴 |
2. 轉(zhuǎn)膜條件
不同分子量的蛋白質(zhì)選擇的凝膠濃度和轉(zhuǎn)膜時(shí)間也是不同的，原則上高分子量蛋白用低濃度膠，轉(zhuǎn)膜時(shí)間較長，而低分子量蛋白用高濃度膠分離，采用較短的轉(zhuǎn)膜時(shí)間，下表可供參考：
| 分子量(kDa) |
凝膠濃度 |
轉(zhuǎn)膜時(shí)間（h) |
| 140-200 |
6% |
2.0-3.0 |
| 80---140 |
8% |
1.5-2.0 |
| 25---80 |
10% |
1.5 |
| 15--40 |
12% |
0.75 |
| <20 |
15% |
0.5 |
3. 轉(zhuǎn)膜操作注意事項(xiàng)
（1） 避免直接接觸膜，全程戴手套并使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑；
（2） PVDF膜具有疏水性，使用之前需用甲醇浸泡；
（3） 排列三明治時(shí)，盡量用干凈的玻璃棒或試管趕走膠和膜之間的氣泡，避免轉(zhuǎn)膜不均勻；
（4） 確認(rèn)裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，否則會導(dǎo)致電流不能通過膜，從而轉(zhuǎn)膜無效；
（5） 雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強(qiáng)的結(jié)合能力，從而產(chǎn)生較高背景，故如果選擇雞來源的抗體，最好使用**纖維素膜（NC膜）。
4. 轉(zhuǎn)膜后麗春紅染色
為檢測轉(zhuǎn)膜是否成功，可以用麗春紅進(jìn)行染色，將膜放入TBST洗一次，然后置于麗春紅染色工作液中，室溫下?lián)u動(dòng)染色5分鐘，大量的水洗膜，直至水變清無色，蛋白條帶清晰。
轉(zhuǎn)膜常用產(chǎn)品列表
| 應(yīng)用 |
目錄號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
目錄價(jià) |
| Western轉(zhuǎn)膜試劑 |
70-WB006 |
濕法Western Blot轉(zhuǎn)膜液（40×） |
100ml |
90 |
| 70-WB007 |
Western洗滌液 （20×） |
100ml |
100 |
| 70-WP001 |
Western Blot緩沖液套裝(濕轉(zhuǎn)) |
1kit |
256 |
| Western轉(zhuǎn)印膜 |
70-F4501 |
PVDF片膜(熒光)，0.45um,7.125*8.5cm |
1片 |
80 |
| 70-F4505 |
PVDF片膜(熒光)，0.45um,7.125*8.5cm |
5片 |
350 |
| 70-F4510 |
PVDF片膜(熒光)，0.45um,7.125*8.5cm |
10片 |
650 |
| 70-F4520 |
PVDF片膜(熒光)，0.45um,7.125*8.5cm |
20片 |
1200 |
| 70-F4550 |
PVDF片膜(熒光)，0.45um,7.125*8.5cm |
50片 |
2400 |
| 70-N4501 |
NC片膜，0.45um,7.5*8.5cm |
1片 |
50 |
| 70-N4505 |
NC片膜，0.45um,7.5*8.5cm |
5片 |
200 |
| 70-N4510 |
NC片膜，0.45um,7.5*8.5cm |
10片 |
380 |
| 70-N4520 |
NC片膜，0.45um,7.5*8.5cm |
20片 |
700 |
| 70-N4550 |
NC片膜，0.45um,7.5*8.5cm |
50片 |
1500 |
| 70-P2001 |
PVDF片膜，0.2um,7.5*8.5cm |
1片 |
50 |
| 70-P2005 |
PVDF片膜，0.2um,7.5*8.5cm |
5片 |
200 |
| 70-P2010 |
PVDF片膜，0.2um,7.5*8.5cm |
10片 |
380 |
| 70-P2020 |
PVDF片膜，0.2um,7.5*8.5cm |
20片 |
700 |
| 70-P2050 |
PVDF片膜，0.2um,7.5*8.5cm |
50片 |
1500 |
| 70-P4501 |
PVDF片膜，0.45um,7.125*8.5cm |
1片 |
50 |
| 70-P4505 |
PVDF片膜，0.45um,7.125*8.5cm |
5片 |
180 |
| 70-P4510 |
PVDF片膜，0.45um,7.125*8.5cm |
10片 |
350 |
| 70-P4520 |
PVDF片膜，0.45um,7.125*8.5cm |
20片 |
650 |
| 70-P4550 |
PVDF片膜，0.45um,7.125*8.5cm |
50片 |
1300 |
| 轉(zhuǎn)膜確認(rèn) |
70-WB025 |
麗春紅染色液 |
100ml |
70 |
新品速遞 | 前列腺素E2(PGE2)ELISA Kit
(2019-07-15T09:52 瀏覽數(shù):18623)
做流式有一套|你知道的Treg，答題抽獎(jiǎng)好禮不停
(2019-03-11T09:42 瀏覽數(shù):20289)
聯(lián)科生物喊你吃年夜飯啦！
(2019-01-25T13:37 瀏覽數(shù):21645)
在皮氏培養(yǎng)皿中生長的血管與人類血管非常相似
(2019-01-23T15:04 瀏覽數(shù):20886)
Human ELISA Kit 推薦：人降鈣素ELISA試劑盒
(2019-01-10T14:35 瀏覽數(shù):20386)
聯(lián)科生物新品：妊娠研究相關(guān)試劑盒
(2019-01-09T17:05 瀏覽數(shù):21462)
聯(lián)科生物第四季ELISA大賽——杭州站
(2019-01-04T15:33 瀏覽數(shù):20326)
全血 Foxp3 實(shí)驗(yàn)操作步驟
(2018-12-10T09:52 瀏覽數(shù):26279)
人 Treg 試劑盒操作步驟
(2018-12-06T10:03 瀏覽數(shù):25715)
流式胞內(nèi)染色步驟
(2018-11-12T11:34 瀏覽數(shù):23487)
