代謝組學文章標題：Blockage of?glycolysis by?targeting PFKFB3 suppresses the?development of?infantile hemangioma

發表期刊：Journal of Translational Medicine

影響因子：8.44

作者單位：四川大學華西醫院

百趣提供服務：中心碳代謝

代謝組學分享-研究背景

嬰兒血管瘤(Infantile Hemangioma, IH)是嬰兒最常見的腫瘤，但其確切的發病機制尚不清楚。前期研究發現，糖代謝可能在IH發病機制中發揮重要作用，抑制糖酵解關鍵酶磷酸果糖激酶-1可抑制IH血管生成。代謝組學分享，磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶3 (PFKFB3)是一種將果糖- 6-二磷酸轉化為果糖-2,6-二磷酸的代謝酶，是限速酶磷酸果糖激酶-1最有效的變構激活劑。本研究旨在探討PFKFB3在IH中的作用。

代謝組學分享-結果與分析

1.PFKFB3在增殖期IH組織與HemEC中高表達

共鑒定出222個差異表達基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)（141個上調，81個下調），如下圖所示（圖1A），PFKFB3是最顯著的DEGs之一。DEGs在生物過程中主要富集在 “細胞脂代謝”等過程中（圖1B）；在KEGG途徑中主要富集在“甘油脂代謝”等通路上（圖1C）。代謝組學分享，在對芯片結果驗證過程中，發現PFKFB3蛋白在增殖型IH組織中的表達高于漸開化型消退期IH組織（圖1D）。此外，PFKFB3蛋白在血管瘤內皮細胞(Hemangloma-derived endothelial cell, HemEC)中的表達高于人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)（圖1E）。

總之，細胞代謝與IH的發展密切相關，PFKFB3在增殖的IH組織和HemECs中高表達，可能在IH發展的調節中發揮重要作用。

圖1. PFKFB3在增殖IH組織和HemEC中的過表達

2.PFK15抑制HemEC血管生成

隨著藥物濃度的增加，PFK15（PFKFB3抑制劑）處理引起HemECs的形態學逐漸改變，包括細胞密度下降、細胞收縮和細胞碎片增加（圖2A），PFK15以劑量依賴的方式降低HemECs的活力（圖B）。代謝組學分享，為了進一步驗證PFK15在抑制細胞增殖中的作用，在體外評估了PFK15對HemEC體外成管的影響。結果表明，PFK15顯著抑制血管生成（圖C）。總之，用 PFK15抑制PFKFB3可以降低HemEC血管生成。

圖2. PFK15抑制HemEC血管生成

3.PFK15抑制HemEC葡萄糖代謝

對葡萄糖進行靶向代謝組學分析。PCA（圖3A）圖顯示對照組和PFK15處理組之間存在顯著差。如火山圖（圖3B）和熱圖所示（圖3C），共鑒定出45種差異代謝物。PFKFB3被抑制后，許多糖酵解代謝物，包括葡萄糖6-磷酸、果糖6-磷酸和果糖1,6-二磷酸含量仍比對照組更高（圖3C）。與對照組相比，PFKFB3被抑制后，屬于“TCA循環”的代謝物檸檬酸、異檸檬酸、富馬酸、α酮戊二酸、蘋果酸和琥珀酸也顯著增加（圖C）。代謝組學分享，隨后選取差異最高的14種代謝物進行KEGG通路分析。發現這些代謝物主要富集在糖酵解相關途徑，如“磷酸戊糖途徑”、“糖酵解/糖異生”、“丙酮酸代謝”和“TCA循環”（圖3D，E）。綜上所述，被PFK15抑制的PFKFB3可以減少HemECs的糖代謝。

圖3. PFK15抑制HemEC葡萄糖代謝

4.PFK15抑制HemEC遷移，誘導細胞凋亡

細胞遷移實驗結果顯示PFK15抑制HemECs的遷移（圖4A）。此外，當PFK15聯合普萘洛爾(propranolol)治療時，觀察到一種協同抑制作用（圖4A）。代謝組學分享，為了確定PFK15誘導的協同遷移抑制是否是由于細胞凋亡，使用Annexin V和PI標記進行流式細胞術分析。結果顯示，PFK15處理組的凋亡細胞數量大于對照組（圖4B）。

同樣，PFK15和普萘洛爾聯合治療導致HemECs凋亡百分比顯著增加（圖4B）。此外，通過western blot分析，PFK15和HemECs聯合治療后Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調（圖4C）。代謝組學分享，與對照組相比，PFK15處理后觀察到明顯的線粒體應激反應，包括線粒體基質密度增加，線粒體嵴塌陷，線粒體腫脹和線粒體空泡變性（圖4D）。線粒體應激反應可大大增加活性氧的產生，導致線粒體凋亡通路的激活。結果顯示，與對照組和普萘洛爾組相比，PFK15治療后ROS生成增加（圖4E，F）。

圖4. PFK15抑制HemEC遷移并誘導細胞凋亡

5.shPFKFB3抑制HemEC血管生成

為了進一步研究PFKFB3水平是否影響血管生成活性，我們構建了靶向PFKFB3的慢病毒載體shRNA（圖5A）。代謝組學分享，轉染shPFKFB3后，PFKFB3在HemECs中的蛋白表達水平顯著降低（圖5B）。

敲低PFKFB3也顯著抑制了HemEC的血管生成（圖5C）。shPFKFB3顯著抑制了細胞遷移（圖5D）。此外，shPFKFB3慢病毒組的凋亡細胞比例高于對照組（圖5E）。綜上所述，敲除PFKFB3顯著抑制了HemEC血管生成。

圖5. PFKFB3下調抑制HemEC血管生成并誘導細胞凋亡

6.PFKFB3抑制降低了HemECs中PI3K/Akt信號通路的激活

為了確定PFKFB3被抑制后IH中調控血管生成活性的關鍵通路，對PFK15處理組和對照組進行了轉錄分析。共鑒定出1240個DEGs（357個上調，783個下調）。GO分析顯示，這些DEGs主要富集在“血管生成”、“細胞粘附”和“凋亡過程的正向調控”等生物過程中（圖6A）。KEGG通路分析中顯著富集在PI3K-Akt信號通路（圖6B）。這些數據表明，PI3K-Akt通路可能參與PFK15治療后IH血管生成和細胞代謝的調節。代謝組學分享，此外，對轉錄和代謝結果進行綜合分析的結果顯示，“糖酵解或糖異生”是最重要的途徑（圖6C），表明抑制PFKFB3主要影響HemECs中的糖酵解。

為了進一步證明PI3K-Akt通路在PFKFB3調控中的作用，我們首先使用STRING進行了功能蛋白關聯分析，以建立Akt和PFKFB3之間的潛在關系。可以看出，PFKFB與Akt直接相連，Akt也與Bax和Bcl-2密切相關(圖6D)。接下來，利用Co-IP驗證PFKFB3與Akt之間的蛋白-蛋白相互作用（圖6E）。

由于PI3K/Akt信號通路參與了PFKFB3的調控，我們試圖確定PFK15是否通過該通路誘導HemEC凋亡。Western Blot結果顯示，PFK15降低了PI3K和Akt的磷酸化水平（圖6F）。代謝組學分享，與單獨使用每種藥物相比，PFK15和普萘洛爾聯合使用可進一步降低PI3K/Akt的磷酸化水平（圖6G）。此外，用shPFKFB3敲除PFKFB3可顯著降低PI3K和Akt的磷酸化水平。因此，通過抑制PFKFB3可抑制PI3K-Akt信號通路，誘導細胞凋亡。

圖6. PFKFB3抑制抑制HemECs中PI3K/Akt信號通路的激活

7.抑制PFKFB3可抑制體內IH血管的形成

為了研究我們的體外研究結果是否可以轉化為體內環境，我們使用HemECs和血管瘤源性周細胞建立了小鼠異種移植模型（圖7A）。14d處死實驗動物，解剖實驗動物的腫瘤（圖7B）。代謝組學分享，14d后僅PFK15組和聯合用藥組的腫瘤生長顯著降低（圖7C）。

HE染色結果顯示，PFK15單獨或聯合普萘洛爾可顯著減少微血管數量（圖7C）。此外，與對照組相比，PFK15單獨使用或聯合普萘洛爾可降低CD31基因的表達（圖7C）。轉導shPFKFB3可減少微血管數量和CD31的表達（圖7D），沉默PFKFB3也顯著降低了MVD（圖7F）。所有這些結果都表明，抑制PFKFB3可以抑制體內IH血管的形成。

圖7. 抑制PFKFB3可抑制體內IH血管的形成

代謝組學分享-結論

總之，這些結果表明抑制PFKFB3可以降低IH血管生成并誘導細胞凋亡，靶向PFKFB3可能是IH的一種新的治療策略。