血管負(fù)責(zé)輸送氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，并參與調(diào)節(jié)炎癥、清理代謝廢物等，對人體幾乎所有組織都至關(guān)重要。因此，體外重建功能性血管網(wǎng)絡(luò)是基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用的基礎(chǔ)。而功能性血管網(wǎng)絡(luò)生成的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于內(nèi)皮細(xì)胞 (EC)和血管壁細(xì)胞 (MC，包括周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞) 的協(xié)同分化。這兩種細(xì)胞依賴于緊密關(guān)聯(lián)的信號通路（包括 PDGFB、Notch 和 TGFβ），但所需的培養(yǎng)條件各不相同且通?；ゲ患嫒?，因此共分化極為困難。

直接分離原代細(xì)胞存在重重阻礙，包括技術(shù)難度大、組織來源受限、擴增與穩(wěn)定性較差等，且為倫理和臨床所限制。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）提供的可擴展的、自體來源的血管細(xì)胞或許是一種替代方案，但其依舊存在成熟度不足的問題，限制了在體內(nèi)植入后的存活和功能發(fā)揮。最近的研究雖然引入了血管類器官（VOs）的概念，但這些類器官仍然依賴于MCs的自發(fā)分化，缺乏對細(xì)胞組成的精細(xì)調(diào)控，且在治療應(yīng)用方面存在諸多不足，例如需要培養(yǎng)周期長（約3周）且缺乏可擴展性等。

2025年6月13日，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院聯(lián)合波士頓兒童醫(yī)院及北京大學(xué)等單位，在期刊Cell Stem Cell發(fā)表論文“Rapid generation of functional vascular organoids via simultaneous transcription factor activation of endothelial and mural lineages”，開發(fā)了一種基于hiPSC的快速且明確血管類器官構(gòu)建方案。通過精確激活兩種轉(zhuǎn)錄因子ETV2和NKX3.1，同時驅(qū)動了內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞的形成，僅需5天便獲得了自組裝的功能性血管。基質(zhì)膠等ECM的嵌入推動了血管網(wǎng)絡(luò)的進一步成熟和動脈化。移植小鼠后可重建血管并執(zhí)行血液灌注等生理功能，有助于提高胰島移植的成功率和功能恢復(fù)，具有協(xié)助治療糖尿病等疾病的臨床價值。

該方法首次實現(xiàn)了對構(gòu)建功能性血管所需的兩種主要血管細(xì)胞類型的完全、獨立控制，從而為血管網(wǎng)絡(luò)建模、組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供了一個強大的新平臺。

為了實現(xiàn)對ECs和MCs的共同分化，研究團隊首先利用基因工程手段對hiPSC細(xì)胞系進行了改造，使其能夠在分化為中胚層祖細(xì)胞后，于多西環(huán)素（Dox）誘導(dǎo)條件下分別表達ECs和MCs發(fā)育過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ETV2和NKX3.1。結(jié)果僅需短短5天（傳統(tǒng)方案用時3-4周甚至更久），研究團隊即獲得了數(shù)千個均勻大小的血管類器官（VOs），平均直徑約為250 μm。

中胚層標(biāo)記物TBXT和MIXL1在Dox處理后逐漸下降，表明功能性分化的成功誘導(dǎo)。在Dox處理3天后（培養(yǎng)第5天），約50%的細(xì)胞分化為iECs（iPS生成的ECs），且觀察到了CD31⁺血管網(wǎng)絡(luò)的生成。與此同時，iMCs標(biāo)志物ACTA2和MYH11的檢出也表明，該類器官同時分化出了周細(xì)胞，并具有平滑肌細(xì)胞的特征。

從結(jié)構(gòu)上看，MCs已經(jīng)正確地定位在ECs周圍，形成的典型的血管結(jié)構(gòu)顯示出早期的管腔形成跡象，雖然尚未開放或灌注，但其結(jié)構(gòu)與新生血管一致，表現(xiàn)出正確的頂?shù)讟O性。

將VOs移植小鼠腎包膜下，觀察到數(shù)周的穩(wěn)定保持，iEC無明顯損失。到第14天，觀察到高度血管化的移植物的形成，組織學(xué)也顯示廣泛的灌注血管網(wǎng)絡(luò)，表明VOs在移植后保留了功能性。

圖：通過ETV2和NKX3.1激活生成和體內(nèi)植入血管類器官

與化學(xué)誘導(dǎo)的VO生成方案相比，基于TF的VO中ECs比例更高（約2%），MCs更為成熟。這可能是由于TF激活后EC和MC在類器官內(nèi)實現(xiàn)了有效的共培養(yǎng)。

具體而言，研究人員通過GO分析發(fā)現(xiàn)，iECs中，脈管系統(tǒng)發(fā)育、血管生成、血管生成和平滑肌細(xì)胞（SMC） 增殖等相關(guān)基因上調(diào)。同樣，iMCs顯示除與成熟間充質(zhì)和壁功能相關(guān)的基因富集，包括間充質(zhì)發(fā)育、分支形態(tài)發(fā)生和動脈發(fā)育等，TGF-β 、BMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管生成調(diào)節(jié)因子（FGF2 和 ANGPT2）的標(biāo)志物也有顯著上調(diào)?？傊?，EC和MC的共同分化通過多個信號通路促進了血管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育。

圖：共表達ETV2和NKX3.1促進iEC和iMC成熟

最后，研究團隊使用scRNA-seq證明，生成的VO成功捕獲了跨iEC和iMC譜系的血管細(xì)胞異質(zhì)性。

需要注意的是，較短的激活時間傾向于產(chǎn)生動脈樣內(nèi)皮細(xì)胞，而較長的激活時間則產(chǎn)生更異質(zhì)的內(nèi)皮細(xì)胞群體，包括具有更強血管生成潛力的靜脈樣細(xì)胞，有助于血管類器官的進一步成熟。這對于調(diào)控血管類器官的發(fā)育和功能具有重要的指導(dǎo)意義。

圖：VO內(nèi)的內(nèi)皮和MC的異質(zhì)性

在血管發(fā)育中，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）不僅能為EC提供物理支撐，使其能夠在三維空間中正確組織，還以高度動態(tài)的信號調(diào)控途徑參與血管形態(tài)發(fā)生的調(diào)控。因此，接下來研究人員進一步探索了外源ECM添加對VOs的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將上述實驗獲得的VOs在膠原蛋白或基質(zhì)膠等ECM中繼續(xù)培養(yǎng)5天（不繼續(xù)Dox誘導(dǎo)），可產(chǎn)生更為成熟的 VO （mVO）。基質(zhì)膠的包埋顯著促進了血管發(fā)育，使得生成的血管網(wǎng)絡(luò)更大、更復(fù)雜，直徑更是從最初的250 μm迅速擴大至近1000 μm。且檢測到致密CD31⁺脈管系統(tǒng)與明顯的管腔，表明內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)成功形成了復(fù)雜的血管結(jié)構(gòu)，類似于體內(nèi)的功能性血管。

圖：嵌入基質(zhì)膠有助于VO的成熟

qPCR結(jié)果顯示，相較于未嵌入ECM的VO-iECs，mVO中內(nèi)皮標(biāo)志物及動脈標(biāo)志物均有顯著上調(diào)，同時靜脈標(biāo)志物表達下調(diào)，表明其向動脈樣身份轉(zhuǎn)變，伴隨著更廣泛的內(nèi)皮成熟。mVO-iMC中，平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物表達增加，周細(xì)胞標(biāo)志物表達則有所下降，符合生理條件下血管成熟中的演變，進一步支持了血管成熟和動脈化。后續(xù)實驗還強調(diào)，該結(jié)果僅歸因于ECM的包埋，而與培養(yǎng)時間的延長無關(guān)。

以上結(jié)果表明，嵌入ECM有助于VOs形成更為成熟、組織程度更高的血管網(wǎng)絡(luò)。這種成熟包括 iECs 的動脈化和跨血管細(xì)胞類型譜系特異性基因的上調(diào)，使 VOs 在轉(zhuǎn)錄上更接近原代細(xì)胞，并強調(diào)了它們的生理相關(guān)性。

接下來，研究團隊試圖用化學(xué)修飾的mRNA（modRNA）替代基因工程手段，通過瞬時轉(zhuǎn)染而非長期誘導(dǎo)激活ETV2和NKX3.1的表達。

他們從未修飾的iPSC開始，首先在2天內(nèi)將其誘導(dǎo)分化為中間體MePC，隨后分別用編碼ETV2和NKX3.1的modRNA各自轉(zhuǎn)染一半MePC，再以1:1的比例混合并搖床培養(yǎng)2天。

同樣在5天內(nèi)，研究團隊獲得了大小均勻的VO（MODRNA-VO），其大小與Dox誘導(dǎo)型VO相當(dāng)，但第5天的iEC比例（20%-30%）比Dox-VOs（約55%）更低。這可能是因為Dox允許持續(xù)激活，而modRNA只會產(chǎn)生短暫（約24小時）的表達。如前所述，縮短轉(zhuǎn)錄因子激活時間傾向于產(chǎn)生主要為動脈樣的iECs，而延長激活時間則產(chǎn)生了具有更強血管生成潛力和更高移植后整合能力的異質(zhì)性iEC群體。

圖：Dox誘導(dǎo)和modRNA介導(dǎo)的VO生成的比較分析

盡管如此，modRNA-VOs中的血管細(xì)胞成熟并未受損，這從iECs和iMCs中關(guān)鍵內(nèi)皮和周細(xì)胞標(biāo)記物的表達中可以看出。此外，與Dox-VOs類似，嵌入膠原蛋白或水凝膠也顯著促進了modRNA-VOs的血管成熟程度。

胰島移植是一種治療1型糖尿?。═1DM）和某些2型糖尿?。═2DM）患者的手術(shù)方法，其基本原理是從供體胰腺中分離出能夠產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞，并將其移植到患者的體內(nèi)，以恢復(fù)內(nèi)源性胰島素的生成，從而實現(xiàn)血糖控制。

不過，移植后的胰島細(xì)胞在早期階段容易受到缺血損傷。血管的植入可以迅速恢復(fù)血液供應(yīng)，減少缺血時間，從而提高胰島細(xì)胞的存活率。此外，血管類器官還為移植的胰島細(xì)胞提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，并幫助改善抑制后的微環(huán)境、提高移植效果、減少并發(fā)癥等。

考慮到以上臨床應(yīng)用場景，研究人員最后在糖尿病免疫缺陷裸鼠的后肢缺血模型中測試了VOs的治療潛力。結(jié)果表明，VOs能夠有效地植入，恢復(fù)灌注，并預(yù)防壞死。在胰島移植模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)與VOs共移植增強了胰島的功能植入，通過促進血管再生，使得使用較少的胰島數(shù)量就能有效地逆轉(zhuǎn)小鼠的糖尿病。

總之，VO在移植小鼠模型后能夠促進強勁的血管重建，從而顯著提高胰島移植的成功率和功能恢復(fù)，有效逆轉(zhuǎn)糖尿病，具有極高的臨床應(yīng)用潛力。

圖：VO的體內(nèi)治療潛力

本文提出的雙TF激活方案代表著一項重大進展。通過快速生產(chǎn)具有可控雙譜系特征的自組裝、功能性血管類器官，該系統(tǒng)為血管疾病建模、療法測試和組織工程提供了一個可擴展的平臺。尤其在嵌入ECM后，更表現(xiàn)出向動脈樣身份的進一步轉(zhuǎn)變。該方案為血管類器官研究的速度和復(fù)雜性樹立了新的標(biāo)桿，并為未來的再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用帶來了希望。

不過，作者也提到，由于兩種轉(zhuǎn)錄因子均由相同的Dox觸發(fā)因子誘導(dǎo)，因此對EC和MC發(fā)育的獨立調(diào)控仍然受限。未來宜使用正交誘導(dǎo)系統(tǒng)（例如結(jié)合Dox和modRNA）進行改進，以期實現(xiàn)更靈活的調(diào)控。此外，目前的懸浮培養(yǎng)也缺乏灌注，限制了模擬剪切應(yīng)力的能力，而剪切應(yīng)力是內(nèi)皮成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。將 VO 整合到可灌注平臺中可能會增強生理相關(guān)性。最后，iPSC 衍生的內(nèi)皮細(xì)胞能否在植入后獲得組織特異性身份也有待進一步研究。