血管負責輸送氧氣和營養物質，并參與調節炎癥、清理代謝廢物等，對人體幾乎所有組織都至關重要。因此，體外重建功能性血管網絡是基礎研究和轉化應用的基礎。而功能性血管網絡生成的關鍵挑戰在于內皮細胞 (EC)和血管壁細胞 (MC，包括周細胞和平滑肌細胞) 的協同分化。這兩種細胞依賴于緊密關聯的信號通路（包括 PDGFB、Notch 和 TGFβ），但所需的培養條件各不相同且通常互不兼容，因此共分化極為困難。

直接分離原代細胞存在重重阻礙，包括技術難度大、組織來源受限、擴增與穩定性較差等，且為倫理和臨床所限制。誘導多能干細胞（iPSCs）提供的可擴展的、自體來源的血管細胞或許是一種替代方案，但其依舊存在成熟度不足的問題，限制了在體內植入后的存活和功能發揮。最近的研究雖然引入了血管類器官（VOs）的概念，但這些類器官仍然依賴于MCs的自發分化，缺乏對細胞組成的精細調控，且在治療應用方面存在諸多不足，例如需要培養周期長（約3周）且缺乏可擴展性等。

2025年6月13日，哈佛大學醫學院聯合波士頓兒童醫院及北京大學等單位，在期刊Cell Stem Cell發表論文“Rapid generation of functional vascular organoids via simultaneous transcription factor activation of endothelial and mural lineages”，開發了一種基于hiPSC的快速且明確血管類器官構建方案。通過精確激活兩種轉錄因子ETV2和NKX3.1，同時驅動了內皮細胞和壁細胞的形成，僅需5天便獲得了自組裝的功能性血管。基質膠等ECM的嵌入推動了血管網絡的進一步成熟和動脈化。移植小鼠后可重建血管并執行血液灌注等生理功能，有助于提高胰島移植的成功率和功能恢復，具有協助治療糖尿病等疾病的臨床價值。

該方法首次實現了對構建功能性血管所需的兩種主要血管細胞類型的完全、獨立控制，從而為血管網絡建模、組織工程和再生醫學提供了一個強大的新平臺。

為了實現對ECs和MCs的共同分化，研究團隊首先利用基因工程手段對hiPSC細胞系進行了改造，使其能夠在分化為中胚層祖細胞后，于多西環素（Dox）誘導條件下分別表達ECs和MCs發育過程中的關鍵轉錄因子ETV2和NKX3.1。結果僅需短短5天（傳統方案用時3-4周甚至更久），研究團隊即獲得了數千個均勻大小的血管類器官（VOs），平均直徑約為250 μm。

中胚層標記物TBXT和MIXL1在Dox處理后逐漸下降，表明功能性分化的成功誘導。在Dox處理3天后（培養第5天），約50%的細胞分化為iECs（iPS生成的ECs），且觀察到了CD31⁺血管網絡的生成。與此同時，iMCs標志物ACTA2和MYH11的檢出也表明，該類器官同時分化出了周細胞，并具有平滑肌細胞的特征。

從結構上看，MCs已經正確地定位在ECs周圍，形成的典型的血管結構顯示出早期的管腔形成跡象，雖然尚未開放或灌注，但其結構與新生血管一致，表現出正確的頂底極性。

將VOs移植小鼠腎包膜下，觀察到數周的穩定保持，iEC無明顯損失。到第14天，觀察到高度血管化的移植物的形成，組織學也顯示廣泛的灌注血管網絡，表明VOs在移植后保留了功能性。

圖：通過ETV2和NKX3.1激活生成和體內植入血管類器官

與化學誘導的VO生成方案相比，基于TF的VO中ECs比例更高（約2%），MCs更為成熟。這可能是由于TF激活后EC和MC在類器官內實現了有效的共培養。

具體而言，研究人員通過GO分析發現，iECs中，脈管系統發育、血管生成、血管生成和平滑肌細胞（SMC） 增殖等相關基因上調。同樣，iMCs顯示除與成熟間充質和壁功能相關的基因富集，包括間充質發育、分支形態發生和動脈發育等，TGF-β 、BMP 信號轉導和血管生成調節因子（FGF2 和 ANGPT2）的標志物也有顯著上調。總之，EC和MC的共同分化通過多個信號通路促進了血管網絡的發育。

圖：共表達ETV2和NKX3.1促進iEC和iMC成熟

最后，研究團隊使用scRNA-seq證明，生成的VO成功捕獲了跨iEC和iMC譜系的血管細胞異質性。

需要注意的是，較短的激活時間傾向于產生動脈樣內皮細胞，而較長的激活時間則產生更異質的內皮細胞群體，包括具有更強血管生成潛力的靜脈樣細胞，有助于血管類器官的進一步成熟。這對于調控血管類器官的發育和功能具有重要的指導意義。

圖：VO內的內皮和MC的異質性

在血管發育中，細胞外基質（ECM）不僅能為EC提供物理支撐，使其能夠在三維空間中正確組織，還以高度動態的信號調控途徑參與血管形態發生的調控。因此，接下來研究人員進一步探索了外源ECM添加對VOs的影響。

結果發現，將上述實驗獲得的VOs在膠原蛋白或基質膠等ECM中繼續培養5天（不繼續Dox誘導），可產生更為成熟的 VO （mVO）。基質膠的包埋顯著促進了血管發育，使得生成的血管網絡更大、更復雜，直徑更是從最初的250 μm迅速擴大至近1000 μm。且檢測到致密CD31⁺脈管系統與明顯的管腔，表明內皮細胞已經成功形成了復雜的血管結構，類似于體內的功能性血管。

圖：嵌入基質膠有助于VO的成熟

qPCR結果顯示，相較于未嵌入ECM的VO-iECs，mVO中內皮標志物及動脈標志物均有顯著上調，同時靜脈標志物表達下調，表明其向動脈樣身份轉變，伴隨著更廣泛的內皮成熟。mVO-iMC中，平滑肌細胞標志物表達增加，周細胞標志物表達則有所下降，符合生理條件下血管成熟中的演變，進一步支持了血管成熟和動脈化。后續實驗還強調，該結果僅歸因于ECM的包埋，而與培養時間的延長無關。

以上結果表明，嵌入ECM有助于VOs形成更為成熟、組織程度更高的血管網絡。這種成熟包括 iECs 的動脈化和跨血管細胞類型譜系特異性基因的上調，使 VOs 在轉錄上更接近原代細胞，并強調了它們的生理相關性。

接下來，研究團隊試圖用化學修飾的mRNA（modRNA）替代基因工程手段，通過瞬時轉染而非長期誘導激活ETV2和NKX3.1的表達。

他們從未修飾的iPSC開始，首先在2天內將其誘導分化為中間體MePC，隨后分別用編碼ETV2和NKX3.1的modRNA各自轉染一半MePC，再以1:1的比例混合并搖床培養2天。

同樣在5天內，研究團隊獲得了大小均勻的VO（MODRNA-VO），其大小與Dox誘導型VO相當，但第5天的iEC比例（20%-30%）比Dox-VOs（約55%）更低。這可能是因為Dox允許持續激活，而modRNA只會產生短暫（約24小時）的表達。如前所述，縮短轉錄因子激活時間傾向于產生主要為動脈樣的iECs，而延長激活時間則產生了具有更強血管生成潛力和更高移植后整合能力的異質性iEC群體。

圖：Dox誘導和modRNA介導的VO生成的比較分析

盡管如此，modRNA-VOs中的血管細胞成熟并未受損，這從iECs和iMCs中關鍵內皮和周細胞標記物的表達中可以看出。此外，與Dox-VOs類似，嵌入膠原蛋白或水凝膠也顯著促進了modRNA-VOs的血管成熟程度。

胰島移植是一種治療1型糖尿?。═1DM）和某些2型糖尿?。═2DM）患者的手術方法，其基本原理是從供體胰腺中分離出能夠產生胰島素的胰島細胞，并將其移植到患者的體內，以恢復內源性胰島素的生成，從而實現血糖控制。

不過，移植后的胰島細胞在早期階段容易受到缺血損傷。血管的植入可以迅速恢復血液供應，減少缺血時間，從而提高胰島細胞的存活率。此外，血管類器官還為移植的胰島細胞提供足夠的營養物質，并幫助改善抑制后的微環境、提高移植效果、減少并發癥等。

考慮到以上臨床應用場景，研究人員最后在糖尿病免疫缺陷裸鼠的后肢缺血模型中測試了VOs的治療潛力。結果表明，VOs能夠有效地植入，恢復灌注，并預防壞死。在胰島移植模型中，研究人員發現與VOs共移植增強了胰島的功能植入，通過促進血管再生，使得使用較少的胰島數量就能有效地逆轉小鼠的糖尿病。

總之，VO在移植小鼠模型后能夠促進強勁的血管重建，從而顯著提高胰島移植的成功率和功能恢復，有效逆轉糖尿病，具有極高的臨床應用潛力。

圖：VO的體內治療潛力

本文提出的雙TF激活方案代表著一項重大進展。通過快速生產具有可控雙譜系特征的自組裝、功能性血管類器官，該系統為血管疾病建模、療法測試和組織工程提供了一個可擴展的平臺。尤其在嵌入ECM后，更表現出向動脈樣身份的進一步轉變。該方案為血管類器官研究的速度和復雜性樹立了新的標桿，并為未來的再生醫學應用帶來了希望。

不過，作者也提到，由于兩種轉錄因子均由相同的Dox觸發因子誘導，因此對EC和MC發育的獨立調控仍然受限。未來宜使用正交誘導系統（例如結合Dox和modRNA）進行改進，以期實現更靈活的調控。此外，目前的懸浮培養也缺乏灌注，限制了模擬剪切應力的能力，而剪切應力是內皮成熟的關鍵調節因子。將 VO 整合到可灌注平臺中可能會增強生理相關性。最后，iPSC 衍生的內皮細胞能否在植入后獲得組織特異性身份也有待進一步研究。