nat. commun.| 單細胞代謝 “黑科技”！破解細胞衰老密碼，線蟲竟成最大贏家？
英文標題：Integrative single-cell metabolomics and phenotypic profiling reveals metabolic heterogeneity of cellular oxidation and senescence
中文標題：整合單細胞代謝組學和表型分析揭示細胞氧化和衰老的代謝異質性
發表期刊：nature communications
影響因子：14.7
研究背景：
在生命科學領域，細胞的復雜性與異質性備受關注。單細胞分析技術的發展，讓科學家對單細胞遺傳學、蛋白質組學和代謝組學的異質性有了更深入的研究，在胚胎發育、癌癥、衰老等方面成果顯著，凸顯出細胞異質性研究的重要性。細胞代謝對細胞功能和命運影響重大，但現有多數代謝組學研究集中于勻漿水平，無法揭示單細胞代謝異質性及機制。雖然單細胞質譜技術有所發展，卻難以將代謝與細胞的氧化、衰老等表型聯系起來，限制了對細胞代謝和功能的深入理解?？缒B分析整合單細胞組學與細胞功能或表型，為細胞異質性研究帶來新契機。以 Patch-seq 技術為例，其在糖尿病研究中發揮重要作用，揭示了細胞功能與基因表達譜的關聯。在其他細胞研究中，跨模態分析也貢獻突出?；诖耍狙芯繉渭毎|譜與活細胞成像技術相結合，構建跨模態分析平臺，旨在探究單細胞代謝組與細胞氧化、衰老狀態的關聯，為相關研究開辟新路徑。
研究結果：
1、SCLIMS 驅動的單細胞研究：從氧化應激建模到代謝關聯解析
本研究為探究單細胞代謝組與表型特征的聯系，搭建起單細胞活細胞成像與質譜技術整合的跨模態分析平臺（SCLIMS）。研究選用細胞氧化應激（Oxidative Stress, OS）模型，以 HEK293T 細胞為對象，經過氧化氫處理并恢復后，細胞活力適宜單細胞質譜（Single-Cell Mass Spectrometry, SCMS）分析。借助 DCFDA 染色評估細胞氧化應激水平，具體而言，先將細胞與 DCFDA 進行孵育，隨后通過顯微鏡完成成像；緊接著運用微移液器結合膜片鉗技術采集單細胞樣本，開展單細胞質譜分析；最后將所得熒光強度數據與單細胞代謝組學特征進行精準匹配，成功構建代謝組與氧化水平的成對數據集（圖 1a）。
在數據分析階段，研究人員篩選特定質荷比范圍的離子信號，經數據庫匹配注釋和二級質譜確認，獲取用于通路富集分析的代謝物。熱圖呈現出單細胞代謝物豐度隨 DCFDA 熒光強度改變的情況（圖 1b），發現多種代謝物受 DCFDA 強度影響，體現出氧化應激對細胞代謝影響顯著。
為驗證實驗準確性，研究人員采用主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）、均勻流形近似與投影（Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP）和 t 分布隨機鄰域嵌入（t-distributed Stochastic Neighbor Embedding, t-SNE）等方法，對比經 DCFDA 處理和未處理細胞的代謝組。結果顯示，兩種細胞的代謝組無顯著差異（圖 1c-e），代謝物間相關性相似（圖 1f）。
綜上，該跨模態分析平臺成功整合單細胞代謝組和細胞表型，穩定性和可靠性高，保留細胞活力和代謝功能，為后續深入研究細胞代謝與氧化應激的關系筑牢基礎。
圖1. 整合單細胞代謝組和細胞表型的跨模態分析平臺
2、SCLIMS 技術：解碼單細胞代謝與氧化應激的關聯密碼
利用 SCLIMS 的多模態特性，研究通過關聯單細胞代謝組學數據與 DCFDA 強度，系統剖析細胞代謝與氧化應激水平的內在聯系（圖 2a）。經 PCA 和層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis, HCA）驗證代謝組學數據無批次效應后，研究發現部分代謝物豐度與 DCFDA 強度顯著相關，如谷胱甘肽（Glutathione, GSH）含量與 DCFDA 強度呈負相關（圖 2a），印證了方法的可靠性。
對整體代謝組分析顯示，多數與氧化應激相關的代謝物呈負相關，表明代謝物下調可能是氧化應激的關鍵特征（圖 2b）。與能量代謝相關的關鍵代謝物，隨著氧化應激水平升高而減少，單細胞能量負荷與氧化應激水平的負相關關系，進一步表明氧化應激對能量代謝的干擾（圖 2c-h）。
通過代謝物集富集分析（Metabolite Set Enrichment Analysis, MSEA）發現，氧化應激過程中，線粒體與能量代謝、氧化還原代謝、脂質代謝、嘌呤和嘧啶代謝以及維生素代謝等多種代謝途徑均受到干擾（圖 2i）。此外，SCLIMS 還首次揭示了氨基酸代謝、糖類及其衍生物代謝等此前未被關注的代謝途徑在氧化應激中的變化（圖 2i），表明氧化應激可顯著影響蛋白質合成與降解、糖基化反應及能量代謝等多種細胞過程。
在小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）中應用 SCLIMS 開展多模態分析發現，MEFs 中關鍵代謝物與氧化應激的相關性，以及受影響的代謝途徑變化模式，均與人胚腎（HEK）細胞高度相似。這證實了 SCLIMS 多模態分析在不同細胞表型中的穩健性。
綜上所述，基于 SCLIMS 的跨模態分析，深度揭示了單細胞代謝與氧化應激之間的緊密內在聯系。這一發現充分凸顯了整合代謝組學與細胞表型分析，對于全面理解不同細胞類型生物學過程的關鍵意義與重要價值。
圖2. 細胞內代謝組與細胞氧化應激水平的相關性分析
3、SCLIMS 助力單細胞代謝剖析：氧化應激中代謝亞型的多元特征挖掘
基于 SCLIMS 獲取的單細胞代謝組數據，通過k-中心點算法聚類分析，將細胞分為六個具有不同代謝特征的亞型（C1-C6）（圖 3a）。各亞型展現出不同的 OS 水平，可通過 DCFDA 強度體現（圖 3b）。擬時間分析顯示，軌跡始于 OS 水平最低的 C1 亞型，經三個分支分別發展至代表低、中、高氧化水平的 C2/C3、C4、C5/C6 亞型（圖 3c），表明細胞 OS 在代謝調控下逐步變化。利用 Wilcox 秩和檢驗分析發現，各亞型具有特定代謝標志物（圖 3d）。對比 C1 與 C6 細胞代謝組并進行代謝物富集分析（圖 3e），結果顯示 C6 細胞中脂質代謝、線粒體功能、氧化還原平衡等相關途徑顯著缺失或富集度低，而甘氨酸和絲氨酸代謝途徑富集度高，縮醛磷脂合成途徑僅在 C6 細胞中富集，驗證了 SCLIMS 的可靠性。此外，SCLIMS 還發現了果糖和甘露糖降解等新的 OS 相關代謝途徑，以及 C1 和 C6 細胞間能量代謝途徑的轉變，表明 OS 過程中 ATP 生成效率降低。
同樣地，在 MEFs 的研究中，同樣利用 SCLIMS 鑒定出六種代謝亞型（M1-M6），且呈現代謝引導的 OS 發展軌跡。MEFs 與 HEK293T 細胞具有相似的代謝特征，高 OS 水平的 M6 亞型中，脂質代謝、線粒體功能等相關途徑同樣缺失或不顯著，進一步證明 SCLIMS 在分析單細胞代謝變化方面的穩健性。
綜上，SCLIMS 不僅驗證了以往研究中的代謝變化，還揭示了與 OS 相關的新代謝途徑及細胞內代謝異質性，凸顯其作為單細胞水平全面分析工具的可靠性與通用性。
圖3. 跨模態分析揭示的亞型特異性代謝特征和代謝組的動態變化
4、SCLIMS 揭示了單細胞代謝組在預測細胞氧化應激狀態方面的能力
盡管細胞在 OS 下的代謝改變與異質性已被深入研究，但代謝與細胞表型間的關聯強度尚不明確。研究團隊借助機器學習，探索單細胞代謝譜預測不同 OS 水平異質性亞型的可能性。
通過采用判別分析算法，基于單細胞代謝特征訓練分類模型，旨在區分先前聚類分析中確定的 6 種特定 OS 水平的亞型（圖 4a）。研究將數據隨機劃分為訓練與測試數據集，在保留所有符合標準的質荷比（m/z）信號且未進行變量選擇的情況下，利用訓練數據集賦予模型基于單細胞代謝組完整特征分類代謝亞型的能力，并通過測試數據集評估其性能。借助受試者工作特征（ROC）曲線和混淆矩陣分析發現，多分類中 ROC 曲線平均曲線下面積（AUC）表現優異，聚類預測準確率也達到較高水平（圖 4b-c），證實單細胞代謝譜可直接預測代謝亞型。
鑒于分類模型僅能預測代謝亞型，無法精準判斷 OS 水平，研究進一步基于神經網絡算法訓練回歸模型（圖 4d），期望利用代謝特征直接預測單細胞 OS 水平。同樣劃分數據集并構建模型后，通過與 DCFDA 強度關聯，實現基于單細胞代謝特征的 OS 水平預測。測試結果顯示，預測值與真實值的相關性良好（圖 4e）。此外，該單細胞代謝譜在小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）中得到驗證，分類模型表現出色，預測的 OS 水平與真實值也呈現顯著相關性。
圖4. 基于單細胞代謝組的機器學習引導的氧化應激水平預測
5、SCLIMS 揭示基于初始細胞的代謝異質性與 OS 狀態之間的因果關系
在細胞研究領域，OS 水平異質性與代謝異質性之間的因果關聯尚不清晰。研究人員猜測基線代謝譜或許會對細胞誘導 OS 后的表型或代謝異質性產生影響。于是，將未受過氧化氫誘導 OS 的細胞定義為 “初始細胞”，代表代謝和表型的基線狀態，借助 SCLIMS 技術展開深入探究。
研究結果顯示，初始細胞的 OS 水平異質性較低（圖 5a），然而其單細胞代謝組卻存在異質性（圖 5b-c）。通過k-中心點聚類分析，基于初始細胞的代謝組學特征，識別出 Cluster-I 和 Cluster-II 兩種主要代謝亞型（圖 5b）。機器學習表明，單細胞代謝組能夠直接預測細胞亞型，有力證實了初始細胞代謝的顯著異質性。對這兩種亞型細胞的代謝物豐度進行差異分析，發現了如次?；撬?、谷胱甘肽等特征代謝物（圖 5c）。
值得關注的是，即使初始細胞未經歷 OS 刺激，兩種亞型間的代謝差異也與不同 OS 水平細胞的代謝變化模式一致。經分析，Cluster-II 中的細胞與高 OS 水平的細胞更相似，Cluster-I 中的細胞則與低 OS 水平的細胞更為相似（圖 5d）。這種現象與高 OS 水平細胞中部分代謝物下調的情況相契合。此外，多種代謝途徑在 Cluster-I 細胞中富含標記代謝物，但在高 OS 水平的 C6 細胞中相較于低 OS 水平的 C1 細胞均呈下調狀態（圖 3e）。
谷胱甘肽是初始細胞代謝異質性的典型例證，如圖展示出 Cluster-I 和 Cluster-II 單個細胞間 GSH 豐度的顯著差異（圖 5e-f）。構建的代謝網絡顯示，兩種亞型細胞中代謝物間的相關性存在差異，具有亞型特異性代謝特征。例如，Cluster-I 中 GSH 與多種代謝物密切相關，而 Cluster-II 中與之顯著相關的代謝物較少（圖 5g）。通過 DyNet 算法計算發現，GSH 是重連程度最高的代謝物，在代謝組中連接其他代謝物時發揮著關鍵作用（圖 5h）。
圖5. 初始細胞中的代謝異質性
6、細胞的代謝異質性決定了它們在 OS 下的衰老命運
OS 常引發早衰，這是關鍵的細胞衰老類型。研究旨在尋找能區分兩種不同代謝亞型細胞的活細胞探針，以探究其在 OS 誘導衰老中的命運。因兩種代謝亞型細胞的谷胱甘肽（GSH）水平存在差異（圖 5e），研究嘗試利用細胞內 GSH 水平來區分它們。
研究人員挑選出 GSH 水平處于不同范圍（5%-50%）的初始細胞，將其與其他初始細胞一同映射到 UMAP 投影圖上，計算不同 GSH 水平細胞與相應代謝亞型（聚類 I/II）的匹配比例（圖 6a）。當選取的高 / 低谷胱甘肽水平細胞占比超過 15% 時，正確匹配比例大幅下降，表明僅 5% - 15% 范圍內的細胞能較好代表相應代謝亞型的代謝組，反映細胞對 OS 的抗性或敏感性（圖 6b-g）。為保證實驗穩定性，研究人員選取 GSH 水平最高和最低的 5% 的細胞，分別命名為 “代謝組類似抗 OS 細胞（C1）的初始細胞”（MROR 細胞）和 “代謝組類似對 OS 敏感細胞（C6）的初始細胞”（MROS 細胞）。
隨后，研究人員運用活細胞 GSH 熒光染料（mClB）和熒光激活細胞分選技術（FACS）分離 MROR 和 MROS 細胞（圖 6h）。分離前，MROR 和 MROS 細胞的 DCFDA 強度差異較小，但誘導 OS 后，MROS 細胞的 DCFDA 強度顯著高于 MROR 細胞（圖 6i-j），這表明 MROS 細胞的 OS 狀態加劇。同時，SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色結果（圖 6k-l）進一步證實 MROS 細胞在 OS 誘導衰老中的敏感性。
綜上，基于 SCLIMS 技術獲得的數據表明，初始細胞的代謝特征很可能決定其在 OS 及 OS 誘導衰老過程中的命運。
圖6. 細胞內代謝特征在決定細胞在氧化應激及氧化應激誘導的衰老過程中命運的作用
7、通過 SCLIMS 鑒定出的關鍵代謝物可減輕氧化應激和細胞衰老
研究發現，SCLIMS 鑒定出的關鍵代謝物下調或許是引發 OS 的因素之一，這意味著針對性補充代謝物或能逆轉 OS 及 OS 誘導的細胞衰老。為此，研究人員選取了次牛磺酸（hypotaurine）、磷酸肌酸（phosphocreatine）和 O-磷酸乙醇胺（O-phosphoethanolamine）三種關鍵代謝物開展實驗。這三種代謝物在 OS 狀態下含量下降（圖 2b），在不同代謝亞型（C1-6）中呈異質性分布（圖 3d），還可作為區分不同命運初始細胞的代謝標記物（圖 5c）。
用這三種代謝物處理細胞后，細胞內 OS 水平下降，通過細胞內 DCFDA 熒光強度降低可證實這一點（圖 7a-b）。鑒于 OS 是細胞衰老的常見誘因且在自然衰老中作用關鍵，研究人員探究了這些關鍵代謝物對 OS 誘導的細胞衰老的影響。SA-β-Gal 染色結果（圖 7c-d）顯示，這三種代謝物顯著減輕了細胞衰老。同時，這些代謝物緩解了細胞生長停滯（圖 7e-f），恢復了在細胞 OS 過程中受損的線粒體膜電位（Mitochondrial Membrane Potential, MMP）（圖 7g-h）。在氧化應激條件下對小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）檢測發現，使用這三種關鍵代謝物也得到類似結果，表明它們在多種細胞類型中普遍適用。綜上所述，SCLIMS 技術鑒定出的代謝物可通過降低 OS 水平、緩解細胞衰老發揮保護作用。
圖7. 關鍵代謝物對氧化應激和誘導衰老的影響
8、通過 SCLIMS 鑒定出的具有保護作用的代謝物可促進健康衰老并延長壽命
在確認關鍵代謝物對兩種不同細胞類型的氧化應激和衰老具有調節作用后，研究人員進一步探究其對動物衰老的影響，為此引入秀麗隱桿線蟲衰老模型（圖 8a）。在秀麗隱桿線蟲 L4 階段及整個生命周期，向其生長培養基中添加不同濃度的次?；撬?、磷酸肌酸和 O-磷酸乙醇胺這三種關鍵代謝物，然后評估線蟲的氧化應激水平、壽命和健康狀況。
研究發現，添加這些關鍵代謝物顯著延長了線蟲壽命（圖 8b）。通過 DHE 染色評估發現，老年線蟲氧化應激水平較高，而補充關鍵代謝物可緩解這一情況（圖 8c-d）。在運動能力方面，衰老會使線蟲活動能力下降，表現為擺尾頻率降低和自由移動速度減慢，補充關鍵代謝物能改善這些狀況（圖 8e-h）。
綜上，經 SCLIMS 鑒定的這些關鍵代謝物，在秀麗隱桿線蟲中展現出通過預防細胞氧化應激和衰老，進而延長壽命、促進健康衰老的潛力。
圖8. 代謝干預可延長秀麗隱桿線蟲的壽命并促進其健康衰老
研究小結：
本研究借助單細胞活細胞成像與質譜技術（SCLIMS），深入剖析細胞代謝組與氧化應激及衰老的關聯。研究發現，細胞代謝組存在顯著異質性，由此劃分出的不同代謝亞型細胞，其氧化應激水平各異，特定代謝標記物可用于預測細胞對氧化應激的抗性或敏感性，進而揭示初始細胞代謝組差異或決定其在氧化應激下的命運。實驗證實，補充次?；撬帷⒘姿峒∷岷蚈-磷酸乙醇胺等關鍵代謝物，不僅能降低細胞內氧化應激水平、減輕細胞衰老、恢復線粒體功能，還可調節細胞代謝組，使其趨近于未受氧化應激細胞的狀態。在秀麗隱桿線蟲衰老模型中，這些關鍵代謝物同樣展現出延長壽命、緩解氧化應激、改善運動能力的效果。研究成果揭示了細胞代謝在氧化應激和衰老進程中的關鍵作用，為衰老干預及相關疾病研究提供了新方向。