JIPB(IF=9.3)！中科院昆明植物所研究團隊首次破解四種野生樹莓基因組！

研究背景

以覆盆子（R.idaeus）為代表的栽培樹莓，因其果實富含抗癌活性的花青素、鞣花單寧等多酚，成為食藥兩用的明星作物。而野生近緣種如庫頁懸鉤子（R.sachalinensis）與覆盆子的分類爭議、西南特色野生種橢圓懸鉤子（R.ellipticus）和紅藨刺藤（R.niveus）的無刺栽培推廣，均因基因組數據匱乏限制了其分子機制研究。本研究通過多組學整合，首次完成4種野生樹莓的染色體級基因組組裝，并基于125個種質的重測序數據系統解析屬內系統發育關系，揭示中國野生樹莓在起源、進化及果實品質調控中的核心價值，為抗逆育種與功能品種改良提供關鍵靶點。

研究結果

1、四種樹莓屬植物基因組組裝及比較基因組學研究

本研究首次完成了四種野生樹莓（R.idaeus、R.sachalinensis、R.ellipticus和R.niveus）的高質量基因組組裝，各基因組組裝和注釋詳見表1。對于基因組組裝質量，其組裝序列中超過99.7%被錨定到偽染色體上，scaffold N50值高達33.86-40.79 Mb（圖1A）。其中，R.ellipticus實現了無缺口的完整組裝，其他三種物種的基因組僅含2-3個缺口（表1）。對于基因組的共線性與完整性，四物種組裝的（亞）基因組與已發布的R.occidentalis、R.idaeus “Anitra”、R.chingii和R.corchorifolius基因組高度共線（圖1B），且通過BUSCO評估，證明其基因組質量優異（表1）。此外，透過泛基因組與核心基因組分析，平均約64.0%的基因家族構成了核心基因組（圖1D），四種物種分別擁有358-518個物種特異基因家族（圖1E），主要富集于植物生長發育相關功能。

結合系統發育樹，懸鉤子屬（Rubus）位于薔薇亞科內，是薔薇屬（Rosa）、草莓屬（Fragaria）和委陵菜屬（Potentilla）合并分支的姐妹分支（圖1F）?；贑AFE v3.0分析，R.ellipticus和R.niveus在懸鉤子屬進化中表現出顯著的基因家族擴張（圖1F）。擴張基因家族主要富集于生物合成和代謝過程，包括黃酮類和萜類相關通路，這可能與其果實的高營養價值和藥用成分相關。

表1 四種中國樹莓的基因組組裝和注釋

圖1 樹莓的比較基因組學和進化基因組學

2、高度雜合樹莓的亞基因組分型與進化

利用SubPhaser v1.24，成功實現R. idaeus（Ili）和R. sachalinensis兩種樹莓的亞基因組分型，發現亞基因組A或B特異k-mer主要富集于著絲粒區域，其著絲粒序列特征可作為亞基因組分配的潛在標記（圖2A-B）。此外，兩物種對應的亞基因組在七條染色體上共享著大量古代基因組成分（I or i），LTR-RTs插入時間差異，揭示著不同進化起源，暗示著二者共同祖先可能曾發生過古同倍體雜交事件（圖2C）。

為探究亞基因組起源與進化關系，以Fragaria vesca為外類群，從八個懸鉤子物種中提取9,102個直系同源群（圖2D）。通過拼接各染色體同源基因構建的七條染色體系統發育樹顯示五種拓撲類型：染色體1/4、2/6關系一致，3/5/7獨立演化；亞基因組B與栽培種“Anitra”高度關聯（除chr7外）。

基于單拷貝基因構建的9,102棵基因樹揭示了“Anitra”與Ili/sachalinensis間的三種拓撲結構，并映射至兩物種的七條染色體（圖2E）?；驑溆成滹@示：染色體6高度保守（反映功能約束），其余染色體重組頻率差異顯著；拓撲結構2（“Anitra”與Ili亞基因組B聚類）主導多數染色體（chr3/7除外）（圖2E），與染色體系統發育模式一致（圖2D）。綜合基因組證據表明，兩物種為漸滲姐妹群，野生與栽培種間存在不完全譜系分選（ILS）事件，結合分子與表型特征，可將R. sachalinensis歸為R. idaeus亞種。

圖2 雜合二倍體樹莓的亞基因組分期與進化

3、中國懸鉤子屬與覆盆子的復雜進化情景

收集約80個懸鉤子屬物種以及17個全球分布的Rubus idaeus樣本進行葉綠體與核基因組的系統發育基因組學分析（圖3A）。主要結果如下：①存在著五個主要分支（Clades I-V），且主要譜系的葉綠體與核基因組拓撲結構基本一致。②R.chamaemorus在核與葉綠體系統發育中均表現出古老分化，其雌雄異株特性使其與其他亞屬差異顯著。③亞屬Malachobatus（Clade III）為單系群，而亞屬Chamaebatus、Cylaetis和Dalibardetrum的物種則在其間穿插分布，表明這些亞屬間存在密切親緣關系。④最大的亞屬Idaeobatus在兩種系統發育樹中均呈現多系性，并分為三個明顯分支（Clades I，II，IV）。

此外，透過SplitsTree網絡分析，不僅確認了Clade I的兩個譜系，還識別出多個混源基因型，這些基因型代表了近期雜交事件，表明地理隔離雖維持了亞洲與西方基因庫的差異，但頻繁基因流動導致了覆盆子復合群的網狀進化（圖3B）。另外，ADMIXTURE分析也揭示了地理上分散的栽培品種間的共享祖先成分，尤其在“Bonus-henricus”、“Cascade Bounty”和“Polka”中表現明顯，反映了復雜的育種歷史（圖3C）。其中，對于“Bonus-henricus”，通過Dsuite分析可知，它是歷史上覆盆子兩個主要進化譜系間基因流動的關鍵橋梁，其基因型在兩種方法中均得到一致支持（圖3D）。綜上，這些發現共同凸顯了自然進化過程與人為因素是如何共同影響了現代覆盆子的遺傳多樣性。

圖3 系統發育基因組不一致與雜交

4、著絲粒序列作為追溯雜交起源的進化指紋

著絲粒獨特的結構組織可能在雜交事件中有效防止著絲粒序列同源化，從而保留雜交基因組中各自特有的祖先序列特征。對于著絲粒序列特征，本研究核心內容如下：①通過CentIER與Hi-C數據整合，發現五種懸鉤子物種的著絲粒位置高度保守（圖4A），且顯著富集Gypsy/Athila（LTR-RTs）等重復元件（圖4B）。②對著絲粒LTRs的系統發育分析顯示，著絲粒特異性衛星DNA的組織在親緣物種中保持著保守特征，在進化過程中發展出獨特的物種特異性重復模式（圖4C）。③不同懸鉤子物種的衛星重復單元存在差異性富集，其中317 TRAs主要在R.niveus中積累，而在R.ellipticus中則為中等豐度（圖4D）。④比對不同樣本至R.idaeus（Ili）基因組，可以看出，北美與歐洲栽培品種在七條染色體上以i（B亞基因組）成分為主導，表明其共享單一祖先譜系。相比之下，中國野生種質在著絲粒區域同時保留了I與i成分（如“Cascade Bounty”），其遺傳多樣性遠高于現代栽培品種，且后者遺傳基礎狹窄，亟需野生資源補充?？傮w而言，分析著絲粒多樣性為理解基因組進化提供了新視角，并支持了野生種質在作物改良中的有效利用。

圖4 覆盆子的著絲粒特性

5、樹莓果實成熟過程的代謝組和轉錄組分析

為探究樹莓的營養特征分子基礎，通過廣泛靶標代謝組學與轉錄組測序，發現R.ellipticus、R.niveus和R.sachalinensis樹莓在果實成熟三個關鍵階段（YF、MF1、MF2）中，MF1階段的代謝重編程最為劇烈，表現為差異積累代謝物（DAMs）和差異表達基因（DEGs）數量顯著增加，可能驅動著果實品質特征的建立（圖5A）。在代謝物積累方面，三個物種在果實成熟過程中代謝物積累呈現明顯差異：藥用化合物（如類黃酮、酚酸、萜類、生物堿）隨成熟逐漸減少，而營養代謝物（如花青素、糖類、氨基酸）則逐漸增加。這種“防御-營養”轉換模式反映了果實發育的生態適應性策略。

6、影響覆盆子果實著色的代謝物和基因

花青素和類胡蘿卜素是樹莓果實著色的主要色素，在R.ellipticus、R.niveus和R.sachalinensis中，成熟果實的主要花青素為矢車菊素或其糖苷衍生物（圖5B）。其中，R.sachalinensis成熟果實以矢車菊素和金絲桃苷為主，多樣性最高；R.niveus以飛燕草素為主，呈現深紫色；R.ellipticus則特異性積累葉黃素和蝦青素，這可能與黃色表型直接相關。值得注意的是，R.ellipticus盡管成熟時呈現黃色表型，但其果實中仍檢測到大量花青素（圖5B），表明其黃色并非由于花青素合成途徑受阻，而是與花青素運輸缺陷相關，具體表現為關鍵基因RelGST在成熟果實中表達顯著下調（圖5C）；相反地，當瞬時過表達35S::RelGST后，其轉錄水平較野生型高34,195.3倍（圖5F），果實顏色顯著加深（圖5E），主要花青素含量顯著提升（圖5G）。

此外，通過系統發育分析，鑒定了與功能已知花青素轉運蛋白同源的GST基因（如RsaGST1、RniGST、RelGST）。加權基因共表達網絡分析（WGCNA）也揭示了RelGST表達與花青素合成結構基因（如RelCHS、RelUFGT）及調控基因（如RelMYB、RelbHLH）的顯著正相關（圖5D），該結果也得到qRT-PCR數據的進一步支持。

圖5 R.ellipticus，R.niveus，和R.sachalinensis的調控網絡

研究小結

本研究通過組裝四種野生樹莓物種的近完整染色體尺度參考基因組，揭示了其進化歷史與果實品質調控機制。泛基因組資源表明，懸鉤子屬中類黃酮/萜類代謝通路的擴展與果實生物活性化合物多樣性密切相關。值得注意的是，著絲粒序列特征可作為亞基因組標記和進化指紋，用于追溯覆盆子的雜交起源。對125份種質資源的群體基因組分析發現，覆盆子中存在廣泛的基因滲入事件，其著絲粒單倍型特征揭示了栽培品種的祖先貢獻。通過整合代謝組學與轉錄組學，鑒定了樹莓果實生物活性化合物合成的關鍵基因與代謝物。關鍵發現是，R.ellipticus的黃色表型源于GST基因介導的花青素運輸缺陷。本研究深化了對中國樹莓物種復雜進化模式的理解，所生成的大規模多組學數據為優質樹莓育種提供了重要資源。