準(zhǔn)確靈敏的核酸檢測在疾病評(píng)估中具有重要意義，尤其是在臨床早期階段。目前的核酸檢測法以PCR方法為代表，具有較高的特異性和靈敏度，但同時(shí)也對(duì)專業(yè)設(shè)備和技術(shù)人員的要求較高，通常需要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。新冠大流行讓人們意識(shí)到即時(shí)診斷的重要性，這就對(duì)核酸檢測在速度和簡便性上提出了更高的要求。
CRISPR/Cas系統(tǒng)原本是細(xì)菌免疫系統(tǒng)的組成部分，因其獨(dú)特的反式切割活性可非特異性切割環(huán)境中的游離核酸，包括熒光報(bào)告分子，因而具備核酸檢測的能力，并被開發(fā)為精準(zhǔn)、快速、低成本和簡便的分子檢測工具，被稱為下一代分子診斷技術(shù)。電化學(xué)發(fā)光(electrochemluminescence, ECL)是電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光的結(jié)合，具有設(shè)備要求簡單、 背景干擾低、 靈敏度高、 動(dòng)態(tài)范圍寬等優(yōu)勢，在生物分析和臨床診斷中引起了越來越多的關(guān)注。近年來，CRISPR核酸檢測技術(shù)也已從熒光信號(hào)檢測迅速發(fā)展到與電化學(xué)檢測聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了靶標(biāo)的精準(zhǔn)識(shí)別和信號(hào)放大。但基于CRISPR的ECL傳感器的應(yīng)用受到了高背景干擾的限制，并且傳統(tǒng)配合物的價(jià)格較昂貴、位阻較大，容易使檢測的靈敏度降低，因此尋找高效、經(jīng)濟(jì)的ECL材料仍是十分必要的。?
江蘇大學(xué)的Liu Pengfei團(tuán)隊(duì)在Biosensors and Bioelectronics期刊上發(fā)表了題為Cas12a-based electrochemiluminescence biosensor for target amplification-free DNA detection的論文，該研究構(gòu)建了一種新的基于CRISPR/Cas12a的ECL生物傳感器L-甲硫氨酸穩(wěn)定金納米團(tuán)簇(Met-AuNCs)。A金納米團(tuán)簇是一種新興的綠色納米材料，具有優(yōu)異的生物相容性和電化學(xué)特性，而Met-AuNCs作為高效ECL發(fā)射器實(shí)現(xiàn)ECL信號(hào)轉(zhuǎn)換。用于HPV-16 DNA的免擴(kuò)增檢測。
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01Met-AuNCs CRISPR系統(tǒng)的原理
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Met-AuNCs CRISPR系統(tǒng)的工作原理如圖1所示。?在電極表面修飾Met-AuNCs以獲得原始信號(hào)。二鐵標(biāo)記的硫代單鏈DNA (SH-ssDNA-Fc)作為非特異性ssDNA隨后被固定在Met-AuNCs表面以抑制其釋放。當(dāng)靶HPV-16 DNA存在時(shí)，Cas12a被激活并切割ssDNA，通過記錄不同濃度靶HPV-16 DNA的ECL信號(hào)實(shí)現(xiàn)定量檢測。
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為了提高M(jìn)et-AuNCs CRISPR系統(tǒng)的檢測靈敏度，作者首先對(duì)TEA、SH-ssDNA-Fc、Cas12a/crRNA的濃度以及Cas12a在SH-ssDNA-Fc上的裂解時(shí)間等幾個(gè)重要反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化（圖2）。
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在最佳反應(yīng)條件下，作者隨后采用一系列不同濃度的HPV-16 DNA加入Met-AuNCs CRISPR系統(tǒng)中。在室溫下孵育10分鐘以激活Cas12a的反式切割能力，再將經(jīng)過修飾的電極用上述反應(yīng)液處理，在ECL檢測。如圖3所示，作者觀察到Met-AuNCs的ECL強(qiáng)度會(huì)隨著HPV-16 DNA濃度的提高而持續(xù)增加，Met-AuNCs CRISPR系統(tǒng)檢測HPV-16的檢出限(LOD)可達(dá)到0.48 pM的水平（圖3）。這一靈敏度要比目前已發(fā)表的幾種CRISPR電化學(xué)檢測系統(tǒng)的檢測水平都要高（表1）。
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03Met-AuNCs CRISPR檢測系統(tǒng)的其它優(yōu)勢
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?除靈敏度高以外，作者在Met-AuNCs CRISPR檢測系統(tǒng)中采用HPV-18 DNA為干擾劑檢測HPV-16 DNA(圖4A)，測試結(jié)果表面該系統(tǒng)具有優(yōu)異的特異性，這很大程度要?dú)w功于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)自身優(yōu)秀的識(shí)別能力；此外，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，作者還對(duì)不同濃度的靶標(biāo)DNA進(jìn)行5次平行測試(圖4B)，測試結(jié)果表明Met-AuNCs CRISPR檢測系統(tǒng)具有較高的重復(fù)性。
圖4. Met-AuNCs CRISPR檢測系統(tǒng)的特異性和重復(fù)性
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?總結(jié)?
綜上所述，作者提出了一種基于Met-AuNCs ECL材料的CRISPR/Cas12a檢測系統(tǒng)，用于HPV-16 DNA檢測。?得益于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的反式切割信號(hào)放大以及Met-AuNCs高效的ECL反應(yīng)水平，該系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)HPV-16 DNA檢測具有超高的靈敏度，并優(yōu)于大多數(shù)的免擴(kuò)增CRISPR技術(shù)。上述研究表明Met-AuNCs CRISPR檢測系統(tǒng)在臨床診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景，并為即時(shí)檢測提供了新方案。