準確靈敏的核酸檢測在疾病評估中具有重要意義，尤其是在臨床早期階段。目前的核酸檢測法以PCR方法為代表，具有較高的特異性和靈敏度，但同時也對專業設備和技術人員的要求較高，通常需要在實驗室內進行。新冠大流行讓人們意識到即時診斷的重要性，這就對核酸檢測在速度和簡便性上提出了更高的要求。

CRISPR/Cas系統原本是細菌免疫系統的組成部分，因其獨特的反式切割活性可非特異性切割環境中的游離核酸，包括熒光報告分子，因而具備核酸檢測的能力，并被開發為精準、快速、低成本和簡便的分子檢測工具，被稱為下一代分子診斷技術。電化學發光(electrochemluminescence, ECL)是電化學和化學發光的結合，具有設備要求簡單、 背景干擾低、 靈敏度高、 動態范圍寬等優勢，在生物分析和臨床診斷中引起了越來越多的關注。近年來，CRISPR核酸檢測技術也已從熒光信號檢測迅速發展到與電化學檢測聯用，實現了靶標的精準識別和信號放大。但基于CRISPR的ECL傳感器的應用受到了高背景干擾的限制，并且傳統配合物的價格較昂貴、位阻較大，容易使檢測的靈敏度降低，因此尋找高效、經濟的ECL材料仍是十分必要的。?

江蘇大學的Liu Pengfei團隊在Biosensors and Bioelectronics期刊上發表了題為Cas12a-based electrochemiluminescence biosensor for target amplification-free DNA detection的論文，該研究構建了一種新的基于CRISPR/Cas12a的ECL生物傳感器L-甲硫氨酸穩定金納米團簇(Met-AuNCs)。A金納米團簇是一種新興的綠色納米材料，具有優異的生物相容性和電化學特性，而Met-AuNCs作為高效ECL發射器實現ECL信號轉換。用于HPV-16 DNA的免擴增檢測。

?

01Met-AuNCs CRISPR系統的原理

?

Met-AuNCs CRISPR系統的工作原理如圖1所示。?在電極表面修飾Met-AuNCs以獲得原始信號。二鐵標記的硫代單鏈DNA (SH-ssDNA-Fc)作為非特異性ssDNA隨后被固定在Met-AuNCs表面以抑制其釋放。當靶HPV-16 DNA存在時，Cas12a被激活并切割ssDNA，通過記錄不同濃度靶HPV-16 DNA的ECL信號實現定量檢測。

?

為了提高Met-AuNCs CRISPR系統的檢測靈敏度，作者首先對TEA、SH-ssDNA-Fc、Cas12a/crRNA的濃度以及Cas12a在SH-ssDNA-Fc上的裂解時間等幾個重要反應條件進行了優化（圖2）。

?

在最佳反應條件下，作者隨后采用一系列不同濃度的HPV-16 DNA加入Met-AuNCs CRISPR系統中。在室溫下孵育10分鐘以激活Cas12a的反式切割能力，再將經過修飾的電極用上述反應液處理，在ECL檢測。如圖3所示，作者觀察到Met-AuNCs的ECL強度會隨著HPV-16 DNA濃度的提高而持續增加，Met-AuNCs CRISPR系統檢測HPV-16的檢出限(LOD)可達到0.48 pM的水平（圖3）。這一靈敏度要比目前已發表的幾種CRISPR電化學檢測系統的檢測水平都要高（表1）。

?

?

03Met-AuNCs CRISPR檢測系統的其它優勢

?

?

?除靈敏度高以外，作者在Met-AuNCs CRISPR檢測系統中采用HPV-18 DNA為干擾劑檢測HPV-16 DNA(圖4A)，測試結果表面該系統具有優異的特異性，這很大程度要歸功于CRISPR/Cas12a系統自身優秀的識別能力；此外，在相同的實驗條件下，作者還對不同濃度的靶標DNA進行5次平行測試(圖4B)，測試結果表明Met-AuNCs CRISPR檢測系統具有較高的重復性。

圖4. Met-AuNCs CRISPR檢測系統的特異性和重復性

?

?總結?

綜上所述，作者提出了一種基于Met-AuNCs ECL材料的CRISPR/Cas12a檢測系統，用于HPV-16 DNA檢測。?得益于CRISPR/Cas12a系統的反式切割信號放大以及Met-AuNCs高效的ECL反應水平，該系統對目標HPV-16 DNA檢測具有超高的靈敏度，并優于大多數的免擴增CRISPR技術。上述研究表明Met-AuNCs CRISPR檢測系統在臨床診斷中具有廣闊的應用前景，并為即時檢測提供了新方案。