J. Nanobiotechnol. | 農業新希望：氧化石墨烯為花生抗鹽增產帶來曙光

文章標題：Seed priming with graphene oxide improves salinity tolerance and increases productivity of peanut through modulating multiple physiological processes

期刊：Journal of Nanobiotechnology

合作單位：青島農業大學

百趣提供服務：新一代代謝組學NGM 2、轉錄組學

花生是豆科植物的典型代表，種植范圍較廣，且富含不飽和脂肪酸，對人類心血管有益，但高鹽環境會嚴重限制花生根系生長、根瘤菌發育、氮固定能力和產量。目前種子引發是一種顯著的土壤堿化管理策略，引種物質可刺激種子萌發的生理和信號過程，并在不污染土壤的情況下提高植物生長后期的耐鹽性。已有研究報道：氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)通過調節養分同化促進植物生長，清除活性氧減少膜脂過氧化等功能來應對植物非生物脅迫響應，然而，人們對非轉基因物質在種子引種中的作用機制知之甚少。非轉基因物質GO能否作為潛在的種子引發候選物質來應對作物鹽分脅迫的問題，目前尚不清楚。本文通過花生生長和田間生長試驗，從生理、轉錄和代謝組學等方面探究鹽脅迫下GO對花生種子萌發、幼苗生長和生產中的作用，為在可持續農業背景下利用納米材料(nanomaterials, NMs)增強豆科植物的抗鹽性和提高生產力提供指導。

首先利用掃描電鏡和拉曼光譜對花生種子中GO的形態和質地進行表征，實驗I（種子萌發實驗）中，種子中的GO表現出堆疊和折疊的形式，具有層狀結構；拉曼光譜顯示GO具有代表性D和G峰（圖1B）。在實驗II（盆栽實驗）中，GO的代表性D和G峰僅在花生莖和根中被檢測到。這些結果表明，種子引發是花生苗期積累GO的有效方法。

圖1. 實驗設計及GO在花生種子和幼苗中的特性

為探究GO在種子萌發階段對花生種子萌發的影響，首先進行了種子萌發實驗，結果發現在種子萌發的6天中，GO誘導的種子帶有突破種皮的自由基的百分比(percentage of seeds with radicals breaking through testa, PSWRB)在第1天明顯增加，發芽率在第5-6天顯著提高（圖2A-B）。接著，利用轉錄組學技術闡明與GO相關基因的表達水平，分析顯示與對照組（CK）組相比，GO處理的花生種子共檢測到1703個差異基因(differentially expressed genes, DEG)，其中有935個基因上調，768個基因下調（圖2C）。KEGG富集分析顯示這些差異基因主要與代謝過程有關，包括淀粉和蔗糖代謝、三羧酸循環以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等途徑；黃酮類生物合成和苯丙類生物合成等次生代謝過程也被富集（圖2D）；基因本體(Gene Ontology, GO)富集分析顯示細胞內信息交換和蛋白質加工也被富集（圖2C）。這表明GO誘導可能影響種子的初級代謝和次級代謝，從而可能促進種子萌發。

圖2. 氧化石墨烯促進了花生種子的萌發

利用非靶代謝組學闡明氧化石墨烯對花生種子代謝物譜的影響，主成分分析(Principal component analysis, PCA)顯示同組生物學重復樣品聚集，GO組和CK組間明顯分離（圖3B）。與CK組相比，GO處理的種子共有64個差異代謝物(differentially accumulated metabolites, DAMs)，其中36個代謝物上調，28個代謝物下調，這些差異代謝物主要為生物堿、氨基酸、苯類和有機酸（圖3A）。KEGG富集分析顯示GO誘導花生種子與氨基酸代謝和次級代謝物生物合成相關的途徑有關（圖3C）。

圖3. 氧化石墨烯處理花生種子DAMs的動態變化

為探究GO誘導對花生幼苗耐鹽性的影響。首先進行盆栽實驗，結果發現單獨GO處理對花生生長發育的影響較小，而在鹽脅迫下，GO誘導改善了花生幼苗高度、根長和鮮重增加（圖4A-C）。接著對每種處理的花生幼苗進行了轉錄組學測序和非靶代謝組學檢測，結果表明GO+NaCl vs. CK和NaCl vs. CK之間共有991個DEGs，KEGG富集分析揭示了DEGs與氮利用、次生代謝和植物激素的有關。代謝組學結果中，PCA分析顯示CK和GO組更密切相關，而NaCl和GO+NaCl組表現出不同的代謝特征，這與表型結果一致。KEGG富集分析表明這些差異代謝物的功能主要與蛋白質、糖和植物激素相關。

通過檢測幼苗根的氮、磷和鉀含量來探究GO是否會影響鹽脅迫下的養分吸收。結果表明，與單獨的鹽脅迫相比，GO誘導增加了根中氮、磷和鉀含量（圖4D）。負責氮吸收的NRT 2轉運蛋白在NaCl組表達最高，GLU和GLUD1_2表達在GO+NaCl組中更高，這使谷氨酸水平恢復（圖4E）。

最后分析了與生長激素和應激反應激素相關的基因表達和含量。與植物激素相關基因中，赤霉素途徑中的上游限速酶KAO和GA20ox在鹽脅迫下降低，而GO誘導部分恢復了它們的表達。鹽脅迫抑制了GA3ox的表達，但GO誘導上調GA3ox表達（圖4F）。生長激素也觀察到類似的模式，鹽脅迫下IAA前體-L-色氨酸的含量最低，而GO誘導部分恢復其含量，同時IAA合成的關鍵酶ALDH和YUCCA在GO+NaCl中表達升高（圖4H）。在應激反應激素中，在鹽脅迫下細胞分裂素前體DMAPP積累，而下游關鍵酶IPT的表達減弱，最終細胞分裂素含量降低?？偟膩碚f，單獨GO誘導對花生幼苗生長的影響有限，但它通過調節氮同化和植物激素代謝來增強耐鹽性。

圖4. GO通過促進植物生長緩解花生鹽脅迫

通過檢測根系中糖和氨基酸的含量，探究GO誘導對花生耐鹽性的影響。結果顯示，GO+NaCl組中可溶性糖和蔗糖含量降低，游離氨基酸的含量升高（圖5A），因此推測GO誘導有助于維持鹽脅迫下花生根系的滲透壓，從而提高耐鹽性。GO+NaCl組中參與D-果糖合成相關基因（INV和malZ）的表達水平降低（圖5B）。相反，負責D-葡萄糖合成的基因的表達升高。GO+NaCl組中與海藻糖合成相關的TPS和ostB（其可以在高滲透環境中保護細胞）上調。GO誘導改善了不溶性淀粉糖的合成（圖5B）。由此可知GO誘導影響鹽脅迫下花生的碳代謝和滲透調節。

圖5. GO通過調節碳代謝緩解花生鹽脅迫

接著，進一步研究了GO誘導在鹽脅迫下花生光合系統調節中的作用（圖6A）。在無脅迫條件下，GO誘導對Fv/Fm和Pn影響較小，但總葉綠素含量增加；在鹽脅迫下，土壤鹽漬化降低Fv/Fm、Pn和總葉綠素含量，而GO誘導改善了此現象（圖6C-E）。GO誘導也提高葉綠素熒光參數（ΦPSII、Fv'/Fm'和ETR）而降低了NPQ（圖6F）。RNA-seq分析發現在無脅迫和鹽脅迫條件下，GO誘導都能提高光合鏈組分中關鍵基因的表達量（如LHCII，光系統II，細胞色素b6/f復合物，光系統I，LHCI，和F-型ATP酶）（圖6B）。這些結果證明，GO誘導的花生鹽脅迫緩解效應與光合系統的強化有關。

圖6. GO通過調節光系統緩解花生鹽脅迫

為探究GO誘導對鹽脅迫下花生抗氧化系統的調節作用，首先測定了鹽脅迫下花生抗氧化關鍵酶的活性。單獨GO處理提高了超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和愈創木酚過氧化物酶(guaiacol peroxidase, G-POD)的活性，在鹽脅迫下，GO誘導提高SOD、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)和過氧化氫酶(catalase, CAT)活性?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)的組織化學染色和數量檢測也表明GO誘導減少了鹽分脅迫下花生葉片中H2O2和O2-的積累（圖7A）。GO誘導的幼苗在鹽脅迫下丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量降低（圖7B）。在無脅迫下，GO組和CK組的相對含水量(The relative water content, RWC)和相對電解質電導率(the relative electrolyte conductivity, REC)沒有差異。在脅迫條件下，GO誘導顯著提高RWC，降低REC。此外，在GO和CK組間的花生葉亞細胞結構中沒有差異；然而，鹽脅迫導致細胞質膜、線粒體和葉綠體嚴重損傷，GO誘導緩解了鹽引起的質膜損傷，并維持了類囊體和質膜的完整性（圖7C）。

圖7. GO通過維持抗氧化系統和質膜完整性緩解花生鹽脅迫

最后探究了在田間生長條件下GO誘導在花生生產力中的潛在作用。在2022年和2023年，GO誘導處理的花生莢果產量提高，但每公頃株數差異不顯著；然而與CK相比，GO誘導顯著增加莢果重量和莢果數量（表1）。

表1 GO對花生產量及產量構成因素的影響

本文基于轉錄組學和非靶代謝組學技術，闡明GO誘導主要通過模擬氨基酸和次生代謝產物的生物合成來提高花生種子的發芽率和PSWRB。此外，當幼苗受到鹽脅迫時，GO誘導能促進花生幼苗生長，還能提高花生葉片的Pn、Fv/Fm、ΦPSII和葉綠素含量，增強抗氧化酶SOD、APX和CAT活性，從而降低鹽脅迫下的MDA含量和相對電解質電導率(relative electrolyte conductivity, REC)，維持質膜完整性。GO誘導還模擬植物激素的生物合成，并調節花生根中碳、氮代謝，從而導致游離氨基酸和養分過度積累來應對鹽脅迫。最后通過大田試驗驗證了GO誘導能提高花生莢果產量（圖8）。盡管如此，有關GO誘導促進花生莢果產量形成的機制，仍有待進一步闡明；此外，未來有關GO誘導的分子生物學研究的研究可以更全面地了解GO與豆科作物的相互作用。

圖8. GO促進花生種子萌發和增強幼苗耐鹽性機制