Cell Metab.｜復旦大學儲以微、駱菲菲團隊：Foxp3改造CAR-T，從「能量危機」到「代謝續航」的實體瘤治療新路徑

英文標題：Foxp3 confers long-term efficacy of chimeric antigen receptor-T cells via metabolic reprogramming

中文標題：Foxp3通過代謝重編程賦予嵌合抗原受體T細胞長期療效

發表期刊：Cell Metabolism

影響因子：27.7

客戶單位：復旦大學生物醫學研究院/基礎醫學院、復旦大學附屬華山醫院

百趣提供服務：經典脂質組

嵌合抗原受體T細胞(Chimeric Antigen Receptor-T, CAR-T)免疫療法在血液癌癥治療中效果顯著，但用于實體瘤治療時面臨困境。腫瘤微環境(Tumor Microenvironment, TME)的低氧和營養匱乏致使CAR-T細胞耗竭，限制了治療效果。調節性T細胞(Regulatory T Cells, Tregs)可在TME中生存和發揮作用，其代謝模式獨特，Foxp3作為Tregs的關鍵轉錄因子，對維持Tregs代謝和功能意義重大。因此，探究將Tregs代謝優勢引入CAR-T細胞，借助調控其代謝來克服TME障礙、防止細胞耗竭，有望提升CAR-T細胞在實體瘤治療中的療效。

1、CAR-T_Foxp3細胞獲得了與CAR-T_Conv細胞不同的代謝特征

研究者為探究Foxp3過表達對CAR-T細胞代謝的影響，選用具有更強擴增能力和持久性的第三代CAR。通過激活健康供體的人T淋巴細胞，分別用GPC3-CAR感染得到常規的 GPC3-CAR-T(CAR-T_Conv)細胞，用GPC3-CAR和Foxp3共同感染培育出GPC3-CAR-T_Foxp3(CAR-T_Foxp3)細胞（圖1A）。

在檢測細胞代謝參數時發現，GPC3蛋白刺激后，CAR-T_Foxp3細胞的細胞外酸化率(Extracellular Acidification Rate, ECAR)和耗氧率(Oxygen Consumption Rate, OCR)低于CAR-T_Conv細胞（圖1B）。利用LC-MS評估[U-C13]葡萄糖和[U-C13]谷氨酰胺代謝通量，結果顯示，CAR-T_Foxp3細胞從[U-C13]葡萄糖產生的相關代謝產物低于CAR-T_Conv細胞，且谷氨酰胺進入三羧酸(Tricarboxylic Acid, TCA)循環的量減少，相關代謝產物水平也更低（圖1C-F）。添加丙酮酸也無法恢復CAR-T_Foxp3細胞降低的ECAR和OCR。同時，CAR-T_Foxp3細胞內ATP水平更低，NAD/NADH比值更高，表明其糖酵解和氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)適度下調（圖1G）。

進一步利用非靶LC-MS篩選，發現CAR-T_Foxp3細胞中與脂質和氨基酸代謝相關的代謝物表達有差異，涉及甘油磷脂代謝等多條途徑。脂質組學及BODIPY染色證實，CAR-T_Foxp3細胞甘油三酯水平和細胞內脂滴含量增加（圖1H-I）。用二氯乙酸鈉(Sodium Dichloroacetate, DCA)處理后，CAR-T_Foxp3細胞脂滴含量降低，暗示Foxp3介導的OXPHOS減少與脂質代謝上調有關（圖1I）。同時，CAR-T_Foxp3細胞線粒體膜電位和質量降低，線粒體功能改變（圖1J） 。綜上，CAR-T_Foxp3細胞的代謝特征與調節性T細胞(Tregs)相似，與CAR-T_Conv細胞不同。

2、CAR-T_Foxp3細胞的代謝特征由Foxp3與Drp1的結合所決定

研究者探究CAR-T_Foxp3細胞代謝模式與Foxp3和線粒體動力學相關蛋白的關系，發現其代謝重編程由Foxp3與Drp1的結合介導。

探究Foxp3與線粒體動力學相關蛋白的相互作用：鑒于CAR-T_Foxp3細胞線粒體膜電位(Mitochondrial Membrane Potential, MMP)和質量改變，研究人員探究Foxp3對Opa1、Drp1、Mfn1和Mfn2等線粒體動力學相關蛋白的作用，以明確其代謝模式的成因。雙分子熒光互補(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)實驗顯示，在HEK293T細胞中Foxp3僅與Drp1存在相互作用（圖2A），谷胱甘肽S-轉移酶下拉(Glutathione S-transferase Pull-down Assay, GST pull-down Assay)實驗加以驗證（圖2B）。構建融合蛋白觀察到Drp1 定位于細胞質，Foxp3在細胞質和細胞核均有分布（圖2C），二者在細胞質共定位，此現象經HEK293T細胞免疫熒光實驗（圖2D）以及以Tregs為對照的CAR-T細胞實驗（圖2E）證實。

研究Foxp3對Drp1磷酸化及線粒體的影響：已知Drp1絲氨酸616位點磷酸化促線粒體裂變，637位點磷酸化助融合。研究發現，Foxp3不影響Drp1表達及絲氨酸637位點磷酸化，卻顯著降低絲氨酸616位點磷酸化水平（圖2F-M）。利用AlphaFold軟件預測結構和對接結果表明，絲氨酸616位點磷酸化影響Foxp3與Drp1結合穩定性。顯微鏡觀察顯示，CAR-T_Foxp3細胞線粒體聚集伸長且數量少于CAR-T_Conv細胞（圖2G-I）。此外，Foxp3對Drp1上游激酶CDK1和ERK1/2無明顯抑制作用（圖2M）。綜合這些結果可知，Foxp3與Drp1結合可能影響Drp1磷酸化和線粒體裂變，進而重編程CAR-T細胞代謝。

確定Foxp3與Drp1結合位點及對代謝的影響：為確定Foxp3與Drp1結合位點及其對代謝的影響，研究人員利用薛定諤軟件進行對接研究，篩選出5個結合穩定性最高的構象。通過構建多種Foxp3序列部分缺失質粒，BiFC實驗發現缺失340-390位氨基酸片段會破壞二者相互作用。構建缺失該片段的CAR-T_{Foxp3(340-390)}細胞后，觀察到其融合線粒體消失、線粒體數量恢復、脂滴含量降低，線粒體質量、MMP、ECAR和OCR增加（圖2G-L），且Drp1絲氨酸616位點磷酸化增強（圖2M）。研究還預測Foxp3的340-390片段與Drp1的600-620片段結合，構建缺失600-620片段的Drp1變體后，其BiFC平均熒光強度顯著降低，表明該片段參與二者相互作用，解釋了Drp1絲氨酸616位點磷酸化下調的原因（詳情可查閱補充材料）。

綜上，CAR-T_Foxp3細胞代謝重編程由Foxp3與Drp1結合介導。

3、CAR-TFoxp3細胞不會獲得Tregs的染色質可及性和抑制功能

染色質可及性分析：研究人員利用ATAC-seq技術分析Tregs、CAR-T_Conv和CAR-T_Foxp3細胞全基因組染色質可及性，發現ATAC-seq峰主要集中于啟動子、內含子和遠端基因間區域，降維分析可清晰區分三類細胞（圖3A）。轉錄起始位點(TSS)周圍平均ATAC-seq信號顯示，Tregs讀數濃度低于其余兩組，而CAR-T_Conv與CAR-T_Foxp3細胞信號相近（圖3B）。深入分析發現，Tregs中顯著升高的峰高度富集于TRPS1、RUNX2等轉錄因子識別基序，這些基序與Tregs的抑制功能相關。然而，在CAR-T_Foxp3細胞中，這些基序并不富集，表明二者染色質格局存在差異（圖3C-E）。

細胞因子與標志物檢測：檢測T細胞相關標志物和細胞因子發現，與Tregs相比，CAR-T_Foxp3細胞分泌的IL-10、TGF-β水平較低，CTLA-4抑制性受體表達也降低，且與CAR-T_Conv細胞情況相近（圖3F）。GPC3抗原刺激后，CAR-T_Foxp3、CAR-T_Conv和Tregs細胞中CD39和CD73表達無顯著差異（圖3F）。

抑制功能驗證：通過共培養實驗驗證CAR-T_Foxp3細胞對T_Conv細胞增殖的抑制作用，結果顯示CAR-T_Foxp3組中T_Conv細胞增殖明顯強于Tregs組，與CAR-T_Conv組相近，表明CAR-T_Foxp3細胞無抑制作用。

差異峰與代謝物分析：研究發現，在CAR-T_Foxp3細胞上調、CAR-T_Conv細胞下調的峰中，僅有少量能在Tregs中共同富集（圖3G-H）。通路富集分析表明這些峰集中于細胞代謝過程（圖3I）。質譜檢測發現，CAR-T_Foxp3細胞中乳酸、富馬酸和NADH水平顯著低于CAR-T_Conv細胞，或可解釋CAR-T_Foxp3細胞染色質可及性與代謝相關的變化。

綜上，CAR-T_Foxp3細胞在染色質格局和抑制功能上與Tregs存在根本差異，不會轉化為Tregs。

4、Foxp3介導的代謝下調了CAR-T_Foxp3細胞中與耗竭相關的抑制性分子的表達

接下來，研究者探究了Foxp3介導的代謝對CAR-T_Foxp3細胞活化和功能的影響。

細胞表型與功能檢測：將CAR-T_Foxp3和CAR-T_Conv細胞與GPC3⁺Huh7腫瘤細胞孵育72小時后，CAR-T_Foxp3細胞的CD27、CD28等活化及表型標志物和BCL-6轉錄因子水平更高，CD95、EOMES等水平更低（圖4A-B）。細胞毒性評估表明，CAR-T_Foxp3細胞與CAR-T_Conv細胞殺傷能力相似（圖4C） ，但前者釋放的顆粒酶B、IFN-γ等細胞因子更少（圖4D）。

耗竭標志物分析：GPC3抗原刺激72小時后，CAR-T_Foxp3細胞中PD-1、LAG-3等耗竭標志物表達及三重/雙重陽性比例均低于CAR-T_Conv細胞（圖4E-F）；經三輪抗原刺激后，第12天時CAR-T_Foxp3細胞耗竭分子減少、干細胞標志物CD62L增加，而CAR-T_{Foxp3(340–390)}細胞未維持該優勢（圖4G）。

機制探究：用P110處理增加Drp1絲氨酸616位點磷酸化后，CAR-T_Foxp3細胞耗竭標志物顯著上升，CAR-T_Conv細胞無變化（圖4H）；DCA處理或抑制脂肪酸β氧化，僅使CAR-T_Foxp3細胞耗竭標志物表達增加（圖4I）。表明Foxp3與Drp1的相互作用、p-Drp1受損及Foxp3介導的代謝模式，共同作用下調CAR-T_Foxp3細胞耗竭標志物。

綜上，Foxp3介導的代謝不影響CAR-T_Foxp3細胞毒性，但可下調其與耗竭相關的抑制性分子表達，對細胞功能調控具有重要意義。

5、CAR-T_Foxp3細胞在體內表現出強大的抗腫瘤活性，且耗竭標志物水平降低

通過小鼠皮下異種移植瘤模型及后續分子檢測，證實CAR-T_Foxp3細胞在體內抗腫瘤能力更強且耗竭程度更低。

體內抗腫瘤效果驗證：構建小鼠皮下腫瘤模型，在腫瘤體積約100mm³時（圖5A），注射不同T細胞。結果顯示，CAR-T_Foxp3細胞治療組腫瘤生長最慢（圖5B-C），腫瘤重量更輕（圖5D），表明其具有更強的體內抗腫瘤活性 。

細胞表型與功能分析：第20天對腫瘤組織進行流式細胞術分析發現，與CAR-T_Conv細胞相比，CAR-T_Foxp3細胞CD28表達顯著增加，PD-1、LAG-3、TIM-3等耗竭標志物明顯降低（圖5E-G），三重或雙重陽性率也大幅下降（圖5F）；共聚焦免疫熒光分析顯示，CAR-T_Foxp3細胞中PD-1與CD3積分密度比值更低（圖5H-I），進一步說明其耗竭程度低。

轉錄組水平探究：對腫瘤浸潤的CAR-T細胞進行RNA-seq，主成分分析明確區分CAR-T_Foxp3與CAR-T_Conv細胞；CAR-T_Foxp3細胞中Foxp3持續高表達，TIM-3等耗竭相關基因顯著下調（圖5J），基因集富集分析證實其耗竭狀態更低（圖5K）。此外，轉錄組分析表明CAR-T_Foxp3細胞與Tregs存在根本差異，但部分上調基因在細胞代謝通路富集，提示二者代謝特征有相似之處（圖5L）；同時，CAR-T_Foxp3細胞中線粒體相關通路顯著富集，且Foxp3靶基因在兩類細胞中的表達有差異。

綜上，CAR-T_Foxp3細胞在體內展現出優于CAR-T_Conv細胞的抗腫瘤能力，且耗竭相關抑制性分子表達更低，在腫瘤免疫治療中具有潛在優勢。

6、Foxp3在體內使CAR-T_Foxp3細胞維持持久的抗腫瘤效果以及較低水平的耗竭標志物

腫瘤再攻擊模型實驗：當腫瘤體積達50mm³時（圖6A），預先給予CAR-T細胞，CAR-T_Foxp3組腫瘤清除速度略快于CAR-T_Conv組（圖6B）。腫瘤清除后，兩組外周血CAR-T細胞計數無差異（圖6C），但CAR-T_Foxp3組初始/干細胞記憶T細胞比例更高，終末效應記憶T細胞比例更低（圖6D-E）。第29天再次用腫瘤細胞攻擊，CAR-T_Foxp3組腫瘤生長最慢（圖6F）。

驗證Foxp3關鍵作用：將CAR-T_{Foxp3(340–390)}、CAR-T_Foxp3和CAR-T_Conv細胞注射到荷瘤小鼠（圖6G），初期腫瘤均快速清除（圖6H）。再次攻擊后，CAR-T_{Foxp3(340–390)}組腫瘤生長速度與CAR-T_Conv組相似且快于CAR-T_Foxp3組（圖6I），其TIM-3和LAG-3比例與CAR-T_Conv組相當且高于CAR-T_Foxp3組。

綜上，CAR-T_Foxp3細胞增強的抗腫瘤效果及較低的耗竭相關抑制分子水平依賴于Foxp3的第340-390位殘基，證實了Foxp3在CAR-T細胞抗腫瘤活性中的關鍵作用。

7、人源化NSG模型下CAR-TFoxp3細胞的雙重特性——強抗癌、無免疫抑制

模型構建與細胞檢測：使用CD34造血干細胞構建人源化NSG小鼠，在外周血和脾臟中檢測到多種人類免疫細胞，外周血中人類免疫細胞(hCD45⁺)占總免疫細胞比例超60%，脾臟中人類免疫細胞占活細胞比例可達80%。

抗腫瘤效果：建立皮下異種移植瘤模型并給予不同CAR-T細胞治療（圖7A），CAR-T_Foxp3細胞顯著抑制腫瘤生長，五只小鼠中有兩只完全緩解，其余三只腫瘤大小也明顯減小（圖7B-C）。

細胞及因子分析：第25天分析顯示，與CAR-T_Conv組相比，CAR-T_Foxp3細胞耗竭相關抑制分子（PD-1和LAG-3）水平更低，腫瘤浸潤的CD4⁺T細胞更多（圖7D-F）；兩組腫瘤浸潤的人類免疫細胞組成相似（圖7F），小鼠脾臟重量和重要器官無顯著差異（圖7E）。多重細胞因子檢測表明，CAR-T_Foxp3組中TNF-α和IL-10分泌量更低，細胞因子水平更穩定，IL-1β、IL-4等多種細胞因子平均水平低于CAR-T_Conv組，提示細胞因子風暴減輕，而對CAR-T細胞活化增殖關鍵的IL-2濃度兩組無顯著差異（圖7G）。

綜上，CAR-T_Foxp3細胞在人源化NSG模型中展現出增強的抗腫瘤活性，同時維持安全性，未誘導免疫抑制。

本研究圍繞CAR-T_Foxp3細胞的抗腫瘤作用展開深入探究。通過構建小鼠皮下異種移植瘤模型、腫瘤再攻擊模型以及人源化NSG小鼠模型，從多維度驗證了CAR-T_Foxp3細胞的特性。在小鼠皮下異種移植瘤模型中，CAR-T_Foxp3細胞腫瘤抑制效果顯著，細胞耗竭程度低，且在轉錄組水平展現出獨特的基因表達模式。腫瘤再攻擊模型證實其抗腫瘤作用的持久性，且該效果依賴于Foxp3的第340-390位殘基。在人源化NSG模型中，CAR-T_Foxp3細胞不僅能有效抑制腫瘤生長，實現部分小鼠腫瘤完全緩解，還能維持較低的耗竭標志物水平，減輕細胞因子風暴 ，且不誘導免疫抑制，同時對其他免疫細胞組成及小鼠重要器官無不良影響。這些結果表明，CAR-T_Foxp3細胞在體內具有優異的抗腫瘤活性和良好的安全性，為腫瘤免疫治療提供了新的潛在策略和理論依據。